基于網絡藥理學的黨參干預腸易激綜合征作用機制研究

蒙潔　陳冬梅　劉佳佳　李丹丹　王晶

摘要：目的? 基于網絡藥理學探討黨參治療腸易激綜合征的作用靶點和作用機制。方法? 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選出黨參口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18的化合物作為候選藥效成分，利用HTDocking平臺預測與候選藥效成分匹配的靶蛋白，采用Cytoscape3.7.0軟件構建化合物-靶點網絡。通過GeneCards、NCBI和OMIM數(shù)據(jù)庫查找腸易激綜合征相關基因，利用Cytoscape3.7.0繪制疾病基因蛋白相互作用網絡，并與黨參化合物-靶點網絡進行映射，發(fā)現(xiàn)黨參治療腸易激綜合征的關鍵化合物和潛在作用靶點。使用Funrich3.1.3軟件對潛在作用靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集，對黨參治療腸易激綜合征的作用機制做出合理推測。結果? 共得到黨參候選藥效成分17個，預測作用靶點111個，腸易激綜合征相關基因1368個，黨參治療腸易激綜合征的關鍵化合物15個，潛在作用靶點55個（包括IL6、PTGS2、AKT1、EGFR、IL2、IL10、IL4等），靶點參與的功能主要有免疫應答、炎癥反應等，主要富集通路有TRAILA信號通路、TNF信號通路等448條。結論? 黨參可能通過調節(jié)PTGS2等炎癥因子，參與TRAIL信號通路、TNF信號通路等途徑，調節(jié)免疫反應，從而達到治療腸易激綜合征的目的。

關鍵詞：黨參;腸易激綜合征;免疫反應;炎癥因子;網絡藥理學

中圖分類號：R259.744;R2-05? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）01-0080-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903174

Study on Mechanism of Codonopsis Radix in Treatment of Irritable Bowel Syndrome

Based on Network Pharmacology

MENG Jie， CHEN Dongmei， LIU Jiajia， LI Dandan， WANG Jing

Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To explore the targets and mechanism of Codonopsis Radix in the treatment of irritable bowel syndrome （IBS） based on network pharmacology. Methods Compounds with oral bioavailability of 30% or more and drug-like ratio of 0.18 or higher in Codonopsis Radix were screened as candidate drug-effect components by TCMSP database， and then the biomacromolecules matched with candidate drug-effect components were extracted by HTDocking platform. The compound-target interaction network was constructed by Cytoscape 3.7.0. The genes for IBS was searched by GeneCards， NCBI and OMIM， and the protein interaction （PPI） network was mapped using cytoscape 3.7.0， and mapping with the compound-target network of Codonopsis Radix revealed the key compounds and potential targets of Codonopsis Radix in the treatment of irritable bowel syndrome. Funrich 3.1.3 software was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment on potential targets， and made a reasonable speculation on the mechanism of Codonopsis Radix in the treatment of IBS. Results Totally 17 candidate pharmacodynamic components， 111 predicted targets， and 1368 genes related to IBS were identified. 15 key components of irritable bowel syndrome. There were 55 potential targets， including IL6， PTGS2， AKT1， EGFR， IL2， IL10， IL4， etc.; the main functions involved in the targets were immune response， inflammatory response， etc.， and the main enrichment pathways included TRAILA signaling pathway and TNF signaling

pathway. Conclusion Codonopsis Radix participates in the TRAIL signaling pathway， TNF signaling pathway， etc.， and regulates the immune response through the regulation of inflammatory factors such as PTGS2， so as to achieve the purpose of treating IBS.

Keywords： Codonopsis Radix; irritable bowel syndrome; immune reaction; inflammatory factor; network pharmacology

黨參味甘，性平，有補中益氣、止渴、健脾益肺、養(yǎng)血生津功效。研究表明，黨參及其成方制劑可調理胃腸運動功能[1]，但其整體作用機制尚不清楚。腸易激綜合征是一種臨床常見的胃腸功能性疾病，其發(fā)生與精神緊張、內臟高敏感性、胃腸激素和神經遞質分泌異常、腸道感染有關[2-5]，而腸道高敏感性可能與腸道免疫狀態(tài)改變有關[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學主要采用胃腸動力藥、解痙藥、抗焦慮藥等治療該病，效果不顯著且易反復，中醫(yī)辨證論治效果良好[7-9]。目前相關研究大多集中在生理病理學方面，分子水平的作用機制研究較少。網絡藥理學是一種基于系統(tǒng)生物學的理論，強調對信號通路的多途徑調節(jié)[10]，與中藥多成分-多靶點的特點不謀而合。高通量對接在線分析平臺是基于已經建立的蛋白質數(shù)據(jù)庫，將用戶提交的小分子化合物分別與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質進行虛擬對接，從而預測出小分子化合物作用靶點的一種反向對接服務器[11]。本研究應用網絡藥理學方法，聯(lián)合高通量對接在線分析平臺，探討黨參治療腸易激綜合征的作用靶點和作用機制，旨在從分子水平探討黨參在治療腸易激綜合征中的整體作用，以期為臨床應用提供支持。

1? 資料與方法

1.1? 候選藥效成分及靶蛋白篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選黨參口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18的化學成分作為候選藥效成分。將候選藥效成分提交至PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）獲得其3D結構，保存為sdf格式，采用ChemOffice2017軟件對其3D結構進行MM2能量優(yōu)化，并保存成mol2格式，提交至HTDocking平臺（https：//www.cbligand.org/HTDocking/login.php），篩選分子對接度最高的前10位靶蛋白作為黨參候選藥效成分的作用靶點，使用Cytoscape3.7.0軟件對候選藥效成分與預測靶點繪制化合物-靶點網絡圖。

1.2? 疾病相關基因獲取

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、OMIM（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中，以“irritable bowel syndrome”為檢索詞，限定條件為人，查找腸易激綜合征相關基因（包括已經被證實和預測的基因），整理查找到的所有基因，形成腸易激綜合征相關基因數(shù)據(jù)集。使用Cytoscape3.7.0軟件中的string APP插件，對數(shù)據(jù)集中的所有基因繪制蛋白質相互作用（PPI）網絡。

1.3? 黨參治療腸易激綜合征關鍵靶點和化合物獲取

采用Cytoscape3.7.0軟件對黨參化合物-靶點網絡和腸易激綜合征基因PPI網絡進行映射，獲得黨參治療腸易激綜合征的關鍵靶點和關鍵化合物。

1.4? 關鍵靶點功能注釋和通路富集

采用Funrich3.1.3軟件對獲得的關鍵靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集。

2? 結果

2.1? 黨參候選藥效成分及其靶蛋白

通過TCMSP篩選得到黨參候選藥效成分17個，通過HTDocking平臺篩選出111個與之對接度最高的靶蛋白作為黨參發(fā)揮作用的靶點，候選藥效成分與預測靶點的化合物-靶點網絡圖見圖1，節(jié)點大小代表與其直接相連的邊的條數(shù)多少。候選藥效成分見表1。

2.2? 腸易激綜合征關鍵基因

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查到83個相關基因，在OMIM數(shù)據(jù)庫中查到13個相關基因，在GeneCards中查到1360個相關基因（包括預測的基因），去除重復后共得到1368個與人類腸易激綜合征相關的基因。對所有基因繪制的PPI網絡圖中有1368個點、44 185條邊，選取部分基因進行展示，見圖2，圖中節(jié)點大小代表與其直接相連的邊的條數(shù)多少。

2.3? 黨參治療腸易激綜合征關鍵靶點和關鍵化合物

對圖1和圖2進行映射融合，得到黨參治療腸易激綜合征的關鍵化合物15種、關鍵靶點55個，關鍵化合物-關鍵靶點網絡見圖3。網絡中共有70個點、90條邊，節(jié)點越大，與其直接相連的邊越多，degree值越大。關鍵化合物和關鍵靶點信息注釋情況見表2、表3。

2.4? 關鍵靶點功能注釋和通路富集

對55個關鍵靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集。關鍵靶點的細胞組分、分子功能和生物過程富集情況見圖4～圖6。關鍵靶點的KEGG富集通路共448條，顯著性最強的前10條通路見表4。

3? 討論

本研究通過對黨參化合物-靶點網絡的分析發(fā)現(xiàn)，木犀草素、大豆黃素等15個化學成分是黨參發(fā)揮治療腸易激綜合征作用的主要化合物。在本研究發(fā)現(xiàn)的55個靶點中，木犀草素的作用靶點有31個，7-甲氧基-2-甲基異黃酮的作用靶點有13個，豆甾醇的作用靶點有13個，大豆黃素的作用靶點有9個，3-羥基亞甲基丹參醌的作用靶點有6個，色原酮香豆素A的作用靶點有5個，其余成分的靶點至少有1個。在黨參治療腸易激綜合征的靶點中，PTGS2的degree值為5，表明PTGS2可能對黨參治療腸易激綜合征具有較為關鍵的作用。PTGS2是一種誘導型的即刻反應蛋白，正常情況下不表達，當機體受到某些因素如炎癥因子等刺激時表達即刻上升[12]。另外，白細胞介素（IL）-6、AKT1、IL-2、IL-10和IL-4均參與黨參治療腸易激綜合征的過程。IL-6是一種與炎性反應關系最為密切的炎性因子[13]。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷脂酰肌醇3激酶依賴的機制被胞外信號激活[14]。IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，參與炎癥反應和免疫反應，是目前公認的炎癥免疫抑制因子[15];IL-2是趨化因子家族的一種細胞因子，對機體的免疫應答和抗病毒感染等有重要作用;IL-4對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造血細胞都有免疫調節(jié)作用[16]。

有研究表明，腸易激綜合征相關的通路主要富集在3個模塊，即炎癥反應、腸道功能和精神心理原因[17]。本研究發(fā)現(xiàn)的關鍵靶點大多與炎癥反應相關，炎癥反應相關通路包括TRAIL信號通路、TNF信號通路等。TRAIL信號通路中包含34個黨參作用的關鍵靶點，TRAIL分子可以參與到免疫系統(tǒng)細胞的凋亡中，通過信號轉導調控T細胞的凋亡、自然殺傷細胞的靶向殺傷等[18]。TNF信號通路中包含17個黨參作用的關鍵靶點，腫瘤壞死因子（TNF）-α可通過與TNF受體結合而刺激核因子-κB，從而產生一系列級聯(lián)反應，該過程中的多個靶點可實現(xiàn)內皮細胞的招募、炎性細胞因子的合成、炎癥介質的合成，提示炎癥因子參與腸易激綜合征的形成和發(fā)展，且已有研究表明抗TNF可用于治療炎癥性腸病[19]，所以TNF信號通路可能是黨參治療腸易激綜合征的關鍵通路。本研究發(fā)現(xiàn)，黨參治療腸易激綜合征的作用靶點主要參與免疫應答和炎癥反應過程，這也證實了腸易激綜合征發(fā)生發(fā)展中存在低度炎癥反應[20]。內臟高敏感性是腸易激綜合征的一個重要病因[21]，而低度炎癥狀態(tài)是內臟高敏感性的原因之一[22]，因此，通過緩解腸易激綜合征中的低度炎癥狀態(tài)治療腸易激綜合征是可行的。黨參可能通過調控TNF信號通路和TRAIL信號通路中相關炎癥因子的表達水平，發(fā)揮解除腸易激綜合征中的低度炎癥癥狀的作用，從而緩解腸易激綜合征中的內臟高敏感性，進而達到治療效果，這一結論尚需進一步的實驗驗證。

本研究采用網絡藥理學方法和反向分子對接技術對黨參在治療腸易激綜合征中的可能機制作進行研究，發(fā)現(xiàn)黨參治療腸易激綜合征的化學成分主要是木犀草素等15種，其發(fā)揮治療作用的靶點主要是PTGS2等55個。黨參可能通過對TRAIL信號通路和TNF信號通路等炎癥反應通路的調節(jié)，發(fā)揮治療腸易激綜合征的作用。本研究可為黨參及其制劑治療腸易激綜合征提供一定的依據(jù)，也可為臨床治療腸易激綜合征及新型藥物的開發(fā)提供思路。

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（收稿日期：2019-03-14）

（修回日期：2019-04-18;編輯：陳靜）

基金項目：國家自然科學基金（81760835）;甘肅省高等學?？茖W研究一般項目（2018A-052）

通訊作者：王晶，E-mail：jwang_lanzhou_2017@163.com