甘草超高液相色譜指紋圖譜研究

孫云波　張創(chuàng)峰　畢丹　田清存　崔旭盛　沈碩

摘要：目的? 建立甘草的超高液相色譜（UPLC）指紋圖譜，為其質量標準的建立提供依據(jù)。方法? 采用反相超高液相色譜法，以Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）為色譜柱，乙腈-0.05%磷酸為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL/min，檢測波長分別為237、355 nm，柱溫30 ℃，進樣量2 μL，記錄時間51 min。結果? UPLC指紋圖譜的方法學考察結果符合技術要求。共標定甘草UPLC指紋圖譜的24個指紋峰，指認其中甘草酸、芹糖基異甘草苷、甘草查爾酮A、異甘草素、甘草苷、甘草素、異甘草苷、刺甘草查爾酮和光甘草定9個指紋峰。11批甘草樣品指紋圖譜在波長237 nm處的相似度為0.940～0.988，波長355 nm處的相似度為0.831～0.982。結論? 本研究建立的甘草UPLC指紋圖譜可為甘草質量標準的建立提供依據(jù)。

關鍵詞：甘草;超高液相色譜;指紋圖譜;甘草酸;相似度分析;質量標準

中圖分類號：R284.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）01-0068-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812371

Study on UPLC Fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

SUN Yunbo1，2， ZHANG Chuangfeng1， BI Dan1， TIAN Qingcun3， CUI Xusheng3， SHEN Shuo1，2

1. Beijing Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 102600， China;

2. Hebei Province Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Shijiazhuang 050035， China;

3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Shijiazhuang 050035， China

Abstract： Objective To establish UPLC fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， and to provide a basis to develop the quality standard. Methods RP-UPLC fingerprints were adopted， and Waters Acquity UPLC BEH C18 （1.7 ?m， 2.1 mm × 100 mm） was set as the chromatographic column. Acetonitrile-0.05% phosphoric acid was used as the mobile phase， for gradient elution; the flow rate was 0.4 mL/min; the detection wavelengths were set at 237 nm and 355 nm; the column temperature was kept at 30 ℃; the sample volume was 2 μL; the recording time was 51 min. Results The methodological findings of UPLC fingerprints met the technical standard. 24 fingerprint peaks were marked in Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. 9 fingerprint peaks including glycyrrhizic acid， isoliquiritin apioside， licochalcone A， isoliquiritigenin， liquiritin， liquiritigenin， isoliquiritin， echinatin and glabridin were identified. The similarities of 11 batches of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were among 0.940–0.988 at 237 nm and among 0.831–0.982 at 355 nm. Conclusion The established UPLC fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma can provide basis for the establishment of its quality standard.

Keywords： Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; UPLC; fingerprints; glycyrrhizic acid; similarity analysis; quality standards

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖，春、秋二季采挖，除去須根，曬干。甘草氣微，味甜而特殊，具有和中緩急、潤肺祛痰、止咳平喘、補脾益氣、清熱解毒、調和諸藥之功[1]，為臨床常用補益藥[2]。2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定以甘草苷不得少于0.50%、甘草酸不得少于2.0%作為甘草質量控制標準[1]，但甘草化學成分復雜，含有甘草酸類、黃酮類、多糖類、三萜皂苷類、木質素類及氨基酸類等多種化學成分[3-5]，藥理作用豐富[6-8]，其藥效為多種成分共同發(fā)揮作用的結果，僅對1種黃酮類和1種皂苷類成分進行定量分析不能從整體上反映甘草的內在質量。

中藥指紋圖譜技術作為一種從整體上控制質量的手段，能很好地反映色譜峰信息量較大的中藥質量，特征圖譜則能更好地反映色譜峰信息量相對較少的中藥質量。中藥指紋圖譜具有分析速度快、分離效能高等優(yōu)點，是目前廣泛應用的快速檢驗藥材質量的技術[9-12]。甘草主產地資源豐富，采收較容易，資源易得到保證。由于甘草色譜峰信息量較大且復雜，故本研究采用具有高分離效能的超高液相色譜法（UPLC）建立甘草指紋圖譜，從而對甘草藥材進行更為有效的質量控制，促進道地產區(qū)甘草藥材生產穩(wěn)定發(fā)展。

1? 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)，配有四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進樣恒溫樣本管理器、柱溫箱、PDA檢測器和Empower 3色譜工作站，美國Waters公司;Milli-Q超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore Bedford;KQ-500DB型超聲波清洗器（功率500 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;AL204型、AB135-S型電子分析天平，瑞士Mettler- Toledo International Inc.;JA2603B電子天平，上海精科儀器有限公司;0.2 ?m微孔濾膜（美國Waters）。

甘草酸（上海源葉生物科技有限公司，批號Z30A6B1，純度>98%），芹糖基異甘草苷（上海源葉生物科技有限公司，批號P18M3R1，純度>98%），甘草查爾酮A（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號14022606，純度>98%），異甘草素（上海源葉生物科技有限公司，批號R12A7F19390，純度>98%），甘草苷（中國食品藥品檢定研究院，批號111610-201106，含量以93.7%計），甘草素（上海源葉生物科技有限公司，批號ZM0314BD14，純度>98%），異甘草苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號14012002，純度>98%），刺甘草查爾酮（上海源葉生物科技有限公司，批號RA0817FA14，純度>98%），光甘草定（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號14030509，純度>98%），乙腈（色譜純，美國Fisher），甲酸、冰醋酸、磷酸為分析純，北京化工廠），水為超純水（Milli-Q制備）。11批甘草藥材來自甘肅省不同地區(qū)，經石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司中藥資源部田清存高級工程師鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，樣本存放于北京以嶺藥業(yè)有限公司，樣品來源見表1。

2? 方法與結果

2.1? 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（見表2），柱溫30 ℃，檢測波長分別為237、355 nm，進樣量2 μL。

2.2? 供試品溶液制備

取樣品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，稱定質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻靜止，取上清液，0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3? 對照品溶液制備

取甘草酸、芹糖基異甘草苷對照品適量，精密稱定，置具塞容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含甘草酸1.460 mg、芹糖基異甘草苷1.066 mg的溶液，即得。

2.4? 方法學考察

2.4.1? 精密度試驗

取同一份甘草（S9）供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定，將所得色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版）。在237 nm波長處，以甘草酸峰為參照峰（S），計算其他9個色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.88%，相對峰面積RSD均小于2.97%;在355 nm波長處，以芹糖基異甘草苷峰為參照峰（S），計算其他13個色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.33%，相對峰面積RSD均小于4.34%。所得色譜圖的24個指紋峰，在波長237 nm處的相似度分別為1.000、0.998、0.999、1.000、0.999、1.000，RSD=0.09%;在波長355 nm處的相似度分別為0.999、0.991、0.999、0.999、0.997、0.989，RSD=0.33%。表明儀器的精密度良好。

2.4.2? 穩(wěn)定性試驗

取同一份甘草（S9）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，將所得色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版）。在237 nm波長處，以甘草酸峰為參照峰（S），計算其他9個色譜峰的相對保留時間RSD均小于2.49%，相對峰面積RSD均小于2.77%;在355 nm波長處，以芹糖基異甘草苷峰為參照峰（S），計算其他色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.42%，相對峰面積RSD均小于5.12%。所得色譜圖的24個指紋峰，在波長237 nm處的相似度分別為0.998、0.998、0.999、0.999，0.999、0.999、0.998、0.999，RSD=0.06%;在波長355 nm處的相似度分別為0.996、0.995、0.999、0.998、0.999、0.999，0.997、0.997，RSD=0.16%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.4.3? 重復性試驗

取同一批甘草（S9），按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。237 nm波長處以色譜峰19甘草酸為參照峰（S），計算其他9個色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.00%，相對峰面積RSD均小于3.16%;355 nm波長處以色譜峰8芹糖基異甘草苷為參照峰（S），計算其他13個色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.00%，相對峰面積RSD均小于3.36%。所得色譜圖的24個指紋峰在波長237 nm的相似度分別為1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，RSD=0.00%;在波長355 nm的相似度分別為1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，RSD=0.05%。表明本方法重復性良好。

2.5? 指紋圖譜建立

取11批樣品粉末（過3號篩），分別按“2.2”和“2.3”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，確定指紋峰24個，將對照品溶液色譜峰的保留時間與供試品溶液色譜峰的保留時間以及紫外吸收光譜圖進行比對（見圖1、圖2），鑒定供試品溶液中10個色譜峰，分別為甘草苷（4號峰）、甘草素（12號峰）、甘草酸（19號峰）、光甘草定（24號峰）、芹糖基異甘草苷（8號峰）、異甘草苷（9號峰）、刺甘草查爾酮（15號峰）、異甘草素（16號峰）和甘草查爾酮A（23號峰）。以出峰穩(wěn)定、峰面積較大的19號色譜峰甘草酸為參照峰，將所得11批甘草藥材的UPLC指紋圖譜以AIA格式導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版），選定樣品S9的色譜圖為參照圖譜，設定時間漂移值為0.1，采用中位數(shù)法譜峰自動匹配，進行多點矯正，得到不同批次甘草藥材樣品疊加圖譜及對照圖譜（見圖3、圖4）。計算甘草藥材樣品指紋圖譜與對照圖譜（R）的相似度，結果顯示波長237 nm相似度為0.940～0.988，波長355 nm相似度為0.831～0.982，見表3。

2.6? 指紋圖譜分析

11批甘草指紋圖譜有24個共有峰，237 nm波長處以19號甘草酸峰為參照峰計算另外9個指紋峰的相對保留時間，355 nm波長處以8號芹糖基異甘草苷峰為參照峰計算另外13個指紋峰的相對保留時間結果見表4、表5。將相對保留時間的平均值作為規(guī)定值，11批甘草指紋圖譜24個共有峰相對保留時間均在規(guī)定值±5%范圍內。

3? 討論

本試驗采用UPLC-H-Class PAD檢測器進行全波長掃描，比較波長190～400 nm所得的指紋圖譜色譜圖，結果在237、355 nm波長處吸收較強，圖譜在237、355 nm波長的整體圖譜峰形較佳，成分信息更豐富，故確定指紋圖譜的檢測波長為237、355 nm。本試驗考察了不同色譜柱及不同柱溫（25、30、35 ℃）所得指紋圖譜，結果表明，在30 ℃時，色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）的色譜圖中色譜峰數(shù)量最多且分離效果最好。本試驗比較了不同的流動相（甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%甲酸），結果顯示乙腈- 0.05%磷酸分離效果較好，故選擇乙腈-0.05%磷酸為流動相進行梯度洗脫。在該色譜條件下增加有機相梯度洗脫比例，并延長洗脫時間至102 min，結果表明，51 min后無明顯色譜峰，故將流動相洗脫時間確定為51 min。

本試驗對不同提取方法、提取時間、提取溶劑及其體積進行了比較，結果表明，回流提取和超聲提取，提取30、40 min，提取溶劑為70%乙醇和70%甲醇，提取溶劑體積為10、25、50 mL，對指紋圖譜色譜峰強度與數(shù)目沒有明顯影響，故確定以70%乙醇10 mL超聲提取30 min作為供試品溶液的制備方法。

本試驗采用UPLC-PAD法梯度洗脫建立了甘草指紋圖譜的分析方法，同時對色譜條件和供試品溶液的制備方法進行了優(yōu)化，并進行了方法學考察，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的相對保留時間RSD均小于2.50%，相對峰面積RSD均小于5.12%，表明該方法準確、可靠、重復性良好。對11批甘草藥材樣品的UPLC指紋圖譜進行分析，得到24個共有峰，不同批次甘草UPLC指紋圖譜的指紋峰數(shù)目及相對保留時間在規(guī)定值范圍內，在237 nm波長處的相似度為0.940～0.988，355 nm波長處的相似度為0.831～0.982，表明11批甘草藥材有較好的相似度。

本研究建立了甘草藥材指紋圖譜檢測方法，并對不同批次的甘草藥材指紋圖譜進行分析比較，可為甘草藥材內在的質量標準的建立及鑒別提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-12-29）

（修回日期：2019-03-05;編輯：陳靜）

基金項目：國家自然科學基金青年基金（81503231）;國家中藥標準化項目（ZYBZH-C-HEB-12）;北京市科技計劃（Z161100001816022）

通訊作者：沈碩，E-mail：ssarticle2007@163.com