miR-665通過靶向調(diào)控LLGL1促進(jìn)小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的研究

劉榮鳳 張玲玲 徐志宏 崔彥芝

肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一種侵襲性惡性腫瘤，約占肺癌的13%，侵襲力強(qiáng)，惡性程度高[1]。其臨床特點(diǎn)為：腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短，進(jìn)展快，常伴內(nèi)分泌異?；蝾惏┚C合征[2]。幼蟲巨大致死基因（Lethal giantlarvae,Lgl）是在果蠅里發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Lgl在人類的同源基因LLGL1也同樣擔(dān)負(fù)著抑癌基因的作用[3]。人LLGL1基因位于17號(hào)染色體近著絲點(diǎn)區(qū)，近來的分子學(xué)研究顯示這一區(qū)域可能存在與神經(jīng)外胚層腫瘤相關(guān)基因。目前已有報(bào)道[4-6]顯示LLGL1在乳腺癌、胃癌等多種癌癥中表達(dá)下降或不表達(dá)，提示LLGL1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。miRNA是一類具有蛋白調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度大約22個(gè)核苷酸。miRNA參與細(xì)胞發(fā)育、器官生成、細(xì)胞增殖及凋亡等多種細(xì)胞生命活動(dòng)，并且在控制腫瘤的起始和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7,8]?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)不同的miRNA在多種腫瘤疾病中具有不同功能，可能為癌基因，降低其表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；也可能為抑癌因子，降低其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9,10]。因此對(duì)miRNA深入研究可以為肺癌的診斷及治療提供新的方向。本研究旨在探究miR-665在SCLC中的作用，分析miR-665通過靶向調(diào)控LLGL1對(duì)SCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并為SCLC預(yù)后分子標(biāo)志物提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 研究樣本采集 收集2017年12月-2018年12月期間本院51例SCLC手術(shù)患者腫瘤標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，其中男38例，女13例，平均（57.1±9.4）歲。見表1。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化學(xué)治療，所有新鮮標(biāo)本離體后，均迅速液氮冷凍保存，并經(jīng)術(shù)后病理確診。以上標(biāo)本獲得本院倫理委員會(huì)同意及家屬簽字認(rèn)可，操作符合臨床實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SCLC細(xì)胞株NCI-H1688和NCI-H446細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪于6孔板，約5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞在6孔板中的生長(zhǎng)融合度至70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑說明書轉(zhuǎn)染NC-inhibitor、miR-665 inhibitor或siLLGL1。

1.3 qRT-PCR 使用Trizol從細(xì)胞系和組織樣品提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒（11791200, Thermo Fisher Scientific, Inc）說明書進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-665表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，LLGL1表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參，qRT-PCR結(jié)果以2-△△CT值計(jì)算得到。

表1 小細(xì)胞肺癌患者臨床資料（n=51）Tab 1 Clinical data of patients with small cell lung cancer (n=51)

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScan（http://www.targetscan.org）預(yù)測(cè)miR-665與LLGL1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建LLGL1野生型3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-LLGL1-wt和突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-LLGL1-Mut。在NCI-H1688細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-665 mimics以及pMIR-LLGL1-wt或pMIR-LLGL1-Mut，在NCI-H446細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染NC-inhibitor或miR-665 inhibitor以及pMIR-LLGL1-wt或pMIR-LLGL1-Mut。轉(zhuǎn)染24 h后，加入裂解液裂解15 min。使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega Corporation）分析了熒光素酶的活性。

1.5 Western blot 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞或組織蛋白，遵照BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。按每泳道以50 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37oC封閉1 h。加入一抗LLGL1抗體（1:500, ab39292, Abcam）和GAPDH抗體（1:1,000, ab181602, Abcam），4oC孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:1,000,ab150077, Abcam），室溫孵育1 h。ECL液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。

1.6 免疫組化 組織標(biāo)本石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)石蠟切片。石蠟切片置于65oC烤箱中過夜，然后梯度脫蠟、水化。在組織切片上加入3% H2O2，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片置于檸檬酸鹽緩沖液并采用微波加熱法以修復(fù)抗原。加入5%的正常羊血清封閉，室溫孵育20 min。加入一抗LLGL1抗體（1:100），4oC過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:200），37oC孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37oC孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫染色2 min，然后脫水和中性樹脂封片。

1.7 CCK8法 NCI-H446細(xì)胞、NCI-H1688細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，參照CCK-8試劑盒操作說明書操作向每孔加入10 μL CCK-8溶液，37oC孵育1 h-2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.8 流式細(xì)胞法 NCI-H446細(xì)胞、NCI-H1688細(xì)胞用預(yù)冷的PBS重懸，將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的70%乙醇中固定，置于4oC過夜。去除乙醇后，加入100 μL RNase A，37oC水浴30 min，接著添加400 μL PI染色并混勻，4oC避光30 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.9 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) NCI-H446細(xì)胞、NCI-H1688細(xì)胞用無血清懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，上室中加入100 μL細(xì)胞懸液；在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；置于37oC、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室后用PBS淋洗3次；將小室置于95%乙醇中固定5 min；在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel凝膠置于4oC過夜；次日將液化的Matrigel凝膠用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基以1:6的比例稀釋。隨后加入50 μL Matrigel稀釋液到上室以包被濾膜；置于孵箱中4 h令包被液晾干。剩余步驟同Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) NCI-H446細(xì)胞、NCI-H1688細(xì)胞接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用200 μL的移液器槍頭在正中央位置劃一直線，形成單層細(xì)胞間的劃痕。利用PBS沖洗將脫落的細(xì)胞沖洗掉，直至空中無脫落細(xì)胞存在。最后加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，并分別于0 h、12 h顯微鏡下拍照，整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.11 建立肺癌裸鼠移植瘤模型 選用BALB/c裸鼠12只，4周齡左右，體重13 g-17 g。動(dòng)物飼養(yǎng)于22oC恒溫，40%-75%濕度，12 h光/暗周期條件下，自由獲取水和食物。所有裸鼠隨機(jī)分為NC-inhibitor組（n=6）和miR-665 inhibitor組（n=6）。NCI-H446細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-inhibitor或miR-665 inhibitor（B03001，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）后，配置成濃度約為1×107/mL單細(xì)胞懸液，并分別以0.2 mL/只接種于裸鼠左前上肢腋下處皮下。接種后定期觀察，3周后采用頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體，稱重，拍照，甲醛固定。所有操作均獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)同意，動(dòng)物倫理編號(hào)為IACUC-4thHos Hebmu，操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間以兩單獨(dú)樣本t檢驗(yàn)，三組或三組以上的比較采用one-way ANOVA，P＜0.01為差異顯著。

2 結(jié)果

圖1 miR-665在肺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)LLGL1的靶向調(diào)控。A：qRT-PCR檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中miR-665的表達(dá)水平；B：TargetScan預(yù)測(cè)miR-665與LLGL1的潛在結(jié)合位點(diǎn)；C和D：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)熒光素酶活性；E：qRT-PCR檢測(cè)miR-665的表達(dá)水平；F：qRT-PCR檢測(cè)LLGL1的mRNA表達(dá)水平。G：Western blot檢測(cè)LLGL1蛋白的表達(dá)水平。**P＜0.01。Fig 1 Expression of miR-665 in SCLC tissues and its targeting regulation of LLGL1. A: The expression of miR-665 in SCLC tissues and adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR; B: TargetScan predicted potential binding sites for miR-665 and LLGL1; C and D: Double luciferase reporter assay was used to detect luciferase activity; E: The expression of miR-665 was detected by qRT-PCR; F: The mRNA expression of LLGL1 was detected by qRT-PCR; G: The expression of LLGL1 protein was detected by Western blot. **P＜0.01. SCLC: small cell lung cancer.

2.1 miR-665在肺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)LLGL1的靶向調(diào)控 采用qRT-PCR檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中miR-665的表達(dá)水平，如圖1A所示，miR-665在肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）。采用TargetScan預(yù)測(cè)miR-665的潛在靶基因，結(jié)果顯示，miR-665在LLGL1的3’-UTR區(qū)域具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖1B）。在NCI-H1688細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pMIR-LLGL1-wt或pMIR-LLGL1-Mut以及miR-NC或miR-665 mimics后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pMIR-LLGL1-wt和miR-665 mimics時(shí)，熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而共轉(zhuǎn)染pMIR-LLGL1-Mut和miR-665 mimics時(shí)，熒光素酶活性無明顯變化（圖1C）。將pMIR-LLGL1-wt或pMIR-LLGL1-Mut以及NC-inhibitor或miR-665 inhibitor共轉(zhuǎn)染進(jìn)NCI-H446細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-665 inhibitor能明顯增強(qiáng)pMIR-LLGL1-wt的熒光素酶活性（P＜0.01），而對(duì)pMIR-LLGL1-Mut的熒光素酶活性無明顯影響（圖1D）。采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞中miR-665和LLGL1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-665mimics的NCI-H1688細(xì)胞中miR-665的表達(dá)水平較miR-NC對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），LLGL1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。而轉(zhuǎn)染miR-665 inhibitor的NCI-H446細(xì)胞中miR-665的表達(dá)水平較NC-inhibitor對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），LLGL1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）（圖1E-圖1G）。

圖2 LLGL1在肺癌組織中的表達(dá)。A：免疫組化檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中LLGL1的表達(dá)水平（bar=20 μm）；B：Western blot檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中LLGL1的表達(dá)水平；C：qRT-PCR檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中LLGL1的mRNA表達(dá)水平。**P＜0.01。Tab 2 Expression of LLGL1 in SCLC tissue. A: The expression of LLGL1 in SCLC and normal tissues was detected by immunohistochemistry (bar=20 μm); B: The expression of LLGL1 in SCLC and normal tissues was detected by Western blot; C: The mRNA expression of LLGL1 in SCLC and normal tissues was detected by qRT-PCR. **P＜0.01.

2.2 LLGL1在肺癌組織中的表達(dá) 采用免疫組化檢測(cè)肺癌組織和癌旁正常組織中LLGL1的表達(dá)水平，如圖2A所示，相比癌旁正常組織，肺癌組織中LLGL1的陽性信號(hào)明顯降低（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，肺癌組織中LLGL1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01）（圖2B，圖2C）。

2.3 miR-665和LLGL1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響 在NCI-H446細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC-inhibitor或miR-665 inhibitor以及共轉(zhuǎn)染miR-665 inhibitor和siLLGL1。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖能力。如圖3A所示，轉(zhuǎn)染miR-665 inhibitor的細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯降低，而干擾LLGL1的表達(dá)后，增殖能力則明顯升高（P＜0.01）。流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制miR-665的表達(dá)能明顯降低S期細(xì)胞比值，但干擾LLGL1的表達(dá)則能誘導(dǎo)S期阻滯（P＜0.01）（圖3B）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-665 inhibitor能抑制細(xì)胞的侵襲及遷移能力，但siLLGL1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效果（P＜0.01）（圖3C）。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移能力檢測(cè)結(jié)果同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖3D）。另一方面，在NCI-H1688細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-665 mimics以及共轉(zhuǎn)染miR-665 mimics和LLGL1并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-665能明顯促進(jìn)細(xì)胞的的生物學(xué)行為，但這種促進(jìn)效果會(huì)被LLGL1逆轉(zhuǎn)（圖4A-圖4D）。

圖3 miR-665 inhibitor和siLLGL1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響。A：CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；B：流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的S期比值；C：Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力（bar=25 μm）；D：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力（bar=25 μm）。**P＜0.01。Tab 3 Effects of miR-665 inhibitor and siLLGL1 on proliferation, cycle, invasion and migration of SCLC cells. A: The proliferation ability of cells was detect by CCK8 assay; B: S-phase fraction of cells was detected by flow cytometry; C: The cell invasion and migration was detected by Transwell(bar=25 μm); D: The migration ability of cells was measured by wound healing (bar=25 μm). **P＜0.01.

2.4 miR-665在肺癌裸鼠移植瘤模型中的作用 將轉(zhuǎn)染了NC-inhibitor或miR-665 inhibitor以及miR-NC或miR-665 mimics的NCI-H446細(xì)胞接種于裸鼠皮下構(gòu)建肺癌裸鼠移植瘤模型。21 d后檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-665 inhibitor組裸鼠的腫瘤體積和重量均明顯降低（P＜0.01）（圖5A，圖5B，圖5G）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-665 inhibitor組裸鼠腫瘤組織中LLGL1蛋白的表達(dá)明顯降低于對(duì)照組（P＜0.01）（圖5C）。而過表達(dá)miR-665則產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖5D-圖5F，圖5H）。

3 討論

圖4 miR-665 mimics和LLGL1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響。A：CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；B：流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的S期比值；C：Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力（bar=25 μm）；D：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力（bar=25 μm）。**P＜0.01。Tab 4 Effects of miR-665 mimics and LLGL1 on proliferation, cycle, invasion and migration of SCLC cells. A: The proliferation ability of cells was detect by CCK8 assay; B: S-phase fraction of cells was detected by flow cytometry; C: The cell invasion and migration was detected by Transwell(bar=25 μm); D: The migration ability of cells was measured by wound healing (bar=25 μm). **P＜0.01.

圖5 miR-665在肺癌裸鼠移植瘤模型中的作用。A和D：檢測(cè)腫瘤體積；B和E：檢測(cè)腫瘤重量；C和F：Western blot檢測(cè)腫瘤組織中LLGL1蛋白的表達(dá)；G和H：各組移植瘤圖片。**P＜0.01。Tab 5 The role of miR-665 in a nude mouse xenograft model of SCLC. A and D: tumor volumes; B and E: tumor weights; C and F: the expression of LLGL1 protein in tumor tissues was detected by Western blot; G and H: the images of xenografts. **P＜0.01.

miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，在多種生物學(xué)活動(dòng)包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞周期改變等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如果此過程中miRNA表達(dá)異常，將引起細(xì)胞生命進(jìn)程的紊亂和疾病的發(fā)生[11]。近年來miR-655已證實(shí)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Yang等[12]研究證明包括miR-655在內(nèi)的7種miRNAs在2型糖尿病出現(xiàn)異常表達(dá)。Chang等[13]研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌中miR-655呈現(xiàn)高表達(dá)，可以抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲，同時(shí)在患者的預(yù)后過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。雖然目前已報(bào)道了多種miRNA同肺癌的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[14-16]，但miR-665在SCLC中的作用尚鮮有報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-665在SCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，提示miR-665表達(dá)水平的異常變化可能和肺癌存在相關(guān)性。

miRNA通過與靶mRNA的3'-UTR的完全或不完全堿基配對(duì)結(jié)合而使靶mRNA降解或翻譯抑制，對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，目前估計(jì)人類30%的基因可能被miRNA調(diào)控[17,18]。因此，研究miRNA的作用機(jī)制，需首先要認(rèn)識(shí)miRNA與其靶基因的相互作用。本研究通過TargetScan發(fā)現(xiàn)LLGL1的3’-UTR區(qū)域可能存在位點(diǎn)與miR-665形成互補(bǔ)結(jié)合。我們進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LLGL1是否為miR-665的靶基因，結(jié)果顯示，miR-665 mimics能抑制pMIR-LLGL1-wt的熒光素酶活性，miR-665 inhibitor能增強(qiáng)pMIR-LLGL1-wt的熒光素酶活性，而兩者對(duì)pMIRLLGL1-Mut的熒光素酶活性均無明顯影響。并且qRTPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果也證明了miR-665能負(fù)性調(diào)控LLGL1的mRNA和蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明miR-665能直接靶向作用于LLGL1。

Lgl最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，其主要作用在于調(diào)節(jié)細(xì)胞極性，參與細(xì)胞分化、增殖、遷移、黏附和轉(zhuǎn)化。LLGL1為L(zhǎng)gl的人類同源基因，有研究[19]顯示，它的失活很可能與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。越來越多的證據(jù)表明LLGL1在各種人類腫瘤中起著抑制作用。Kuphal等[20]研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中LLGL1通過下調(diào)MMP2和MMP14的表達(dá)并促進(jìn)E-鈣粘蛋白的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞黏附、抑制細(xì)胞遷移。在本研究中，qRT-PCR、Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示LLGL1在肺癌組織中的表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯降低，這與以往研究結(jié)果類似，提示其具有腫瘤抑制作用。為分析miR-665對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制，我們利用NCI-H446細(xì)胞、NCI-H1688細(xì)胞進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑制miR-665的表達(dá)可以抑制肺癌NCI-H446細(xì)胞的增殖、S期細(xì)胞比值、侵襲和遷移能力，但是干擾LLGL1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效果，隨后我們上調(diào)miR-665的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)肺癌NCI-H1688的增殖、S期細(xì)胞比值、侵襲以及遷移能力，但這種促進(jìn)效果同樣被LLGL1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)。這提示我們miR-665是通過靶向調(diào)控LLGL1從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-665在SCLC中的作用，本研究構(gòu)建了肺癌裸鼠移植瘤模型。我們觀察到抑制miR-665能上調(diào)LLGL1蛋白的表達(dá)并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但過表達(dá)miR-665則產(chǎn)生相反的效果。該結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致，表明miR-665在肺癌中發(fā)揮促癌基因的作用。

綜上所述，本研究觀察到miR-665在SCLC組織中存在異常高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)能抑制肺癌細(xì)胞的增殖、S期阻滯、侵襲和遷移，抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。并進(jìn)一步闡明了miR-665是通過靶向調(diào)控LLGL1在SCLC中發(fā)揮促癌基因的作用。

Author contributions

Liu RF conceived and designed the study. Liu RF and Cui YZ performed the experiments. Zhang LL and Xu ZH analyzed the data. Liu RF and Cui YZ provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.