奧希替尼在非小細胞肺癌靶向治療中的獲得性耐藥機制

趙梓彤 倪羽 李里 信濤

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）分子檢測已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個多樣化的并且仍在擴大的驅(qū)動和維持腫瘤發(fā)生的異常遺傳基因目錄。其中，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變是肺癌致瘤驅(qū)動因素的典型例子，可以作為治療的靶點。大量的隨機試驗和meta分析證實了小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）對EGFR突變型NSCLC患者的治療優(yōu)于細胞毒性藥物，在客觀緩解率（objective response rate, ORR）和無生存進展期（progression-free survival, PFS）方面具有顯著的優(yōu)勢[1]。

盡管有相當大比例患者最初使用EGFR-TKIs治療取得了較好的疾病控制，病情進展仍不可避免[2]?？紤]到腫瘤的形成和腫瘤持續(xù)進展對EGFR阻斷序列的抵抗，EGFR靶向治療產(chǎn)生耐藥性的NSCLC患者的管理是一個獨特且持續(xù)的挑戰(zhàn)。奧希替尼作為第三代EGFR-TKI作用于EGFR激活和T790M耐藥突變，同時對野生型EGFR的抑制作用很低[3]。本文綜述了奧希替尼針對于EGFR突變型NSCLC的基礎(chǔ)生物學(xué)和治療方案，總結(jié)了第三代EGFRTKI獲得性耐藥的病理生物學(xué)機制，并對EGFR-TKI的臨床管理提出了當前的挑戰(zhàn)和展望。

1 奧希替尼的藥代動力學(xué)特點

奧希替尼（AZD9291）是口服不可逆的嘧啶基EGFR-TKI，通過半胱氨酸-797殘基與EGFR T790M或EGFR突變形成不可逆的共價鍵，對EGFR敏感活化突變和T790M耐藥突變具有選擇性抑制作用[4]。在EGFR重組酶測定中，奧希替尼對L858R和L858R/T790M有顯著的活性，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）分別為12 nmol/L和1 nmol/L，而對野生型EGFR的活性較低。在細胞抑制試驗中也發(fā)現(xiàn)了類似的作用。通過奧希替尼對突變和野生型EGFR細胞的EGFR磷酸化體外活性發(fā)現(xiàn)，奧希替尼在抑制定位于EGFR敏感突變（ex19del和L858R）的腫瘤細胞中的EGFR磷酸化方面的作用與早期EGFR-TKIs相似，其IC50為54 nmol/L。在T790M突變細胞系中，奧希替尼在IC50低于15 nmol/L的情況下具有高效力。與早期EGFR-TKIs相比，奧希替尼在野生型細胞系中的活性較低。在人體中，奧希替尼的平均半衰期為48.3 h，達到血漿藥物峰濃度（maximum concentration, Cmax）的時間為6 h，15 d后達到穩(wěn)定狀態(tài)。最大血藥濃度呈劑量依賴性且呈線性藥代動力學(xué)特點[5]。奧希替尼的主要代謝途徑是氧化和脫烷基化，生成兩種活性代謝物：AZ7550和AZ5104。與禁食狀態(tài)下相比，進食高脂肪、高熱量食物時，Cmax和藥時曲線下面積（area under curve, AUC）分別增加14%和19%[5]。

2 奧希替尼的臨床應(yīng)用

AURA研究是對奧希替尼的I期/II期開放性多中心研究，研究對象為初期應(yīng)用EGFR-TKI進展的晚期EGFR突變NSCLC患者。研究目的包括安全性、耐受性和有效性。在升級階段，患者（n=31）沒有通過T790M狀態(tài)進行預(yù)選，而在擴展階段，患者要么通過本地測試，然后通過中心實驗室確認T790M狀態(tài)，要么僅通過中心實驗室測試進行登記。在升級階段，共有157例患者被納入5個劑量組（每日20 mg、40 mg、80 mg、160 mg和240 mg），在任何劑量組中都沒有遇到劑量限制毒性。II期臨床試驗推薦的劑量為每日80 mg且未達到最大耐受劑量。奧希替尼治療T790M陽性NSCLC患者的客觀有效率（objective response rate, ORR）為61%，且各劑量的ORR水平相似，ORR為50%-70%，疾病控制率（disease control rate, DCR）為95%，PFS為9.6個月。在T790M陰性NSCLC患者中，奧希替尼的活性較低，ORR 21%，DCR 61%，PFS為2.8個月（表1）。

AURA試驗的II期擴展研究中，201例患者每天服用80 mg的奧希替尼，結(jié)果ORR為62%，DCR為90%，PFS為12.3個月[6]。AURA2是EGFR突變型NSCLC，且在EGFRTKI使用后有進展，并證實為T790M患者使用奧希替尼的II期單臂研究，其ORR結(jié)果為70%，DCR為92%，PFS為9.9個月[7]。一項III期驗證性研究——AURA 3，在未經(jīng)化療的EGFR-TKI治療后伴有T790M突變的NSCLC患者中進行。共有419例患者被隨機分配到奧希替尼或化療組（培美曲塞+鉑類），分配比例為2:1，后續(xù)加或不加培美曲塞維持治療。最終的結(jié)果顯示，奧希替尼明顯優(yōu)于化療，ORR分別為71%和31%（OR=5.39; 95%CI: 3.47-8.48;P＜0.001），PFS分別為10.1個月和4.4個月（HR=0.32;95%CI: 0.21-0.49）[8]。所有預(yù)定義的亞組中均可見獲益于奧希替尼的PFS。與培美曲塞+鉑類組相比，奧希替尼組的患者生活質(zhì)量更好。前臨床數(shù)據(jù)[9]顯示，通過在猴腦中更高的暴露量來看，奧希替尼與Rociletinib和吉非替尼相比，改善了血腦屏障的通透性。在對AURA和AURA 2患者的合并分析中，有50例患者可評估中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，結(jié)果顱內(nèi)ORR為54%，DCR為92%[10]。在AURA 3研究中，預(yù)先指定的亞組分析報告指出，奧希替尼與化療相比具有更高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）應(yīng)答率（70%vs31%）、更持久的應(yīng)答（8.9個月vs5.7個月）和更長的CNS PFS（11.7個月vs5.6個月）[11]。奧希替尼的顱內(nèi)療效可能為治療具有挑戰(zhàn)性的EGFR突變患者的管理提供一種新的治療選擇[12]。

由于奧希替尼是EGFR敏感突變和T790M、野生型EGFR的選擇性抑制劑，因此在AURA研究中，該藥的耐受性良好。最常見的副作用是腹瀉（33%-47%）、皮疹（34%-43%）、甲溝炎（17%-26%）和皮膚干燥（20%-30%），且低于第一或第二代EGFR-TKIs的研究報道[13]。在1%-4%的AURA研究中發(fā)現(xiàn)了任意等級的間質(zhì)性肺疾病，同時在2%-4%的患者中報告了QTc間期延長，但III級以上不良事件少見。

3 EGFR T790M的檢測方式

第三代EGFR-TKIs的開發(fā)和奧希替尼被用于一線EGFR-TKIs治療后進展的T790M陽性晚期NSCLC患者的批準為檢測T790M提供了動力。對EGFR-TKI獲得性耐藥患者，檢測T790M的標準方法是腫瘤二次活檢[14]，患者或家屬拒絕、腫瘤位置、分子檢測樣本不足以及患者狀態(tài)都會限制其實施[15]。此外，同一患者存在的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和時空變異性也可能導(dǎo)致誤診[16]。

表1 選擇性奧希替尼研究的臨床結(jié)果Tab 1 Efficacy outcomes in selected osimertinib studies

利用血漿循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）檢測T790M狀態(tài)是一種已成功應(yīng)用于突變型患者的策略，并且具有非有創(chuàng)性的優(yōu)點，同時可以進行動態(tài)監(jiān)測[17]。然而，如果血漿T790M狀態(tài)為陰性，若可行仍建議腫瘤組織二次活檢[18]。

以Cobas組織檢測為參照標準，評價了CobasEGFR突變檢測血漿T790M的性能特點。在AURA擴展試驗和AURA 2的研究分析中，Cobas血漿檢測血漿T790M的敏感性、特異性和總體一致性分別為61%、79%和65%。血漿和腫瘤T790M陽性患者的ORR分別為64%和66%[19]。在AURA 3研究中，Cobas血漿檢測血漿T790M的敏感性和特異性分別為51%和77%。在血漿與組織T790M陽性的患者中，ORR（77%vs71%）與PFS（8.2個月vs10.1個月）相似[20]。在Rociletinib的I期研究中，Cobas血漿檢測的敏感性、特異性和一致性分別為64%、69%和86%[21]。

除血漿檢測以外，實時PCR技術(shù)如Bio-Rad Droplet Digital PCR、PANAMutyper、RGQ PCR試劑盒等均可作為T790M突變的檢測方法。其中Therascreen EGFR血漿RGQ PCR試劑盒用于檢測EGFR外顯子19、外顯子20 T790M和外顯子21 L858R的缺失情況，并對突變情況進行定性評價。PANAMutyper EGFR試劑盒基于肽核酸介導(dǎo)的實時夾閉和熔融峰分析，設(shè)計了檢測47種不同EGFR變異體的方法。用PNA構(gòu)建PCR鉗制反應(yīng)，鉗制抑制野生型DNA的擴增，增加突變序列的優(yōu)先擴增。而Bio-Rad Droplet Digital PCR建立了一套數(shù)字化PCR系統(tǒng)，對qPCR進行了優(yōu)化[13]。

通過對Cobas、Therascreen、ddPCRTM和BEAMing四個平臺的交叉對比研究，發(fā)現(xiàn)T790M檢測的敏感性分別為41%、29%、71%和71%，特異性分別為100%、100%、83%和67%[22]。近年來，Cobas?EGFR突變檢測與MiSeq NGS的敏感性、特異性和一致性相比分別為93%、92%和92%[19]。

4 第三代EGFR-TKI的獲得性耐藥機制

與使用第一代或第二代EGFR-TKIs治療的患者相似，使用奧希替尼治療的患者最終會產(chǎn)生耐藥性。在前臨床和臨床研究中都報道了幾種依賴EGFR和非依賴EGFR的耐藥機制（圖1）。

4.1 依賴于EGFR的機制 依賴EGFR的機制包括EGFRC797S突變的發(fā)生，這是第三代EGFR-TKIs最常見的耐藥機制之一[23,24]。這個耐藥性突變是奧希替尼針對ATP結(jié)合處的半胱氨酸-797殘基為靶點[25]，該突變發(fā)生在位于激酶結(jié)合位點的EGFR C797密碼子上，導(dǎo)致奧希替尼與EGFR的共價結(jié)合缺失。除了奧希替尼外，在使用Rociletinib、奧莫替尼和Narzatinib治療的EGFR T790M患者中也有C797S的報道[26-28]。有研究[29]顯示，獲得C797S的等位基因環(huán)境可以預(yù)測EGFR-TKI治療的敏感性。體外研究已經(jīng)報道了C797S和T790M的反式突變對第三代EGFRTKIs有耐藥性，但對第一代和第三代TKIs的聯(lián)合應(yīng)用敏感，而如果C797S和T790M發(fā)生順式突變，則EGFR-TKIs單獨或聯(lián)合作用無效。這些前臨床的發(fā)現(xiàn)得到了最近一份涉及一個EGFRT790M和C797S反式突變病例報道的支持，該病人對厄洛替尼和奧希替尼的組合有反應(yīng)[30]。最近又報道了一種新的伴有MYC和EGFR擴增的EGFRC797G順式突變[31]。T790M缺失引起的耐藥性在早期的奧希替尼應(yīng)用中經(jīng)常出現(xiàn)，與存在T790M的患者相比，T790M缺失的患者治療失敗時間更短[32]。

圖1 第三代EGFR-TKIs患者EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及EGFR依賴和獨立耐藥機制示意圖。耐藥機制報道臨床樣本包括EGFR C797S以及其他罕見的三級EGFR突變，MET、HER-2、FGFR和KRAS擴增、PIK3CA和BRAF V600E突變、EGF的過度表達、MAPK的激活、小細胞肺癌轉(zhuǎn)化，還報道了多種復(fù)雜的分子畸變。Fig 1 A simplified represented of the mechanisms of resistance to EGFR-TKIs. Reported drug-resist mechanism clinical samples include EGFR C797S and other rare tertiary EGFR mutations, MET, HER-2, FGFR and KRAS amplification, PIK3CA and BRAF V600E mutations, overexpression of EGF, activation of MAPK, transformation of small cell lung cancer, and a variety of complex molecular aberrations were also reported. EGFR-TKIs:epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors; HER-2: human epidermal growth factor receptor 2; FGFR: fibroblast growth factor receptor; KRAS: Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog; PIK3CA: phosphatidylin-ositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene; BRAF: v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1; MAPK: mitogen-activated protein kinase; NF-κB: nuclear factor kappa B.

Piotrowska等[33]最近的一項研究對Guardant Health數(shù)據(jù)庫的61例C797S突變肺腺癌患者血漿樣本的進行了評估。所有患者均有T790M突變，隨后使用奧希替尼進行治療。所觀察的C797S構(gòu)型示：有50例（82%）順式C797S/T790M患者；反式C797S/T790M患者占6例（10%）；僅有C797S無T790M患者占4例（6%）；1例（2%）患者同時存在2個C797S克?。?個T790M順式克隆，1個反式克?。?。此外，51例（84%）患者至少有一種耐藥機制與C797S同時發(fā)生；EGFR擴增（n=29;48%）；MET擴增（n=10; 16%）；BRAFV600E （n=3;5%）和PIK3CA突變（n=9; 15%）。因此，C797S的多克隆性以及真實的耐藥機制反映了耐藥EGFR突變腫瘤的異質(zhì)性。

除了C797S，還有其他的罕見三級EGFR突變，包括新的溶劑前突變（G796S/R）、位于792位的亮氨酸殘基鉸鏈口袋突變（L792F/H）、位于798位的結(jié)合干擾（L798I）以及位于718位的空間位阻（L718Q）[27,34-37]。所有的L792突變都是T790M的順式突變和C797的反式突變。Ou等[37]報道，10例L792陽性患者中有2例、7例L718陽性患者中有6例沒有同時存在C797突變。耐藥突變的多樣性可能是由于腫瘤的異質(zhì)性，這代表一個治療的挑戰(zhàn)并對未來的藥物開發(fā)有指導(dǎo)性作用。

由EGFR敏感活化突變、T790M和三級EGFR突變組成的三重突變是一個重要的臨床挑戰(zhàn)，第四代EGFR選擇性突變、變構(gòu)性非ATP競爭性抑制劑（如EAI045）正在開發(fā)中[25]。在L858R/T790M/C797S小鼠模型中，EAI045與西妥昔單抗具有協(xié)同作用?；衔颎o6976的結(jié)構(gòu)研究[38]表明，一種有效的蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）抑制劑可優(yōu)先與EGFR T790M/C797S結(jié)合，也可能克服C797S的存在。

4.2 非依賴EGFR的機制 在腫瘤和/或血漿樣本中報道的不依賴EGFR耐藥機制包括MET擴增[39-41]、HER-2[39,42]和FGFR[43]、MAPK激活[43]、KRAS突變、PI3KCA[35]、BRAF[44]、PTEN缺失[36]和向小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）轉(zhuǎn)化[45]。此外，SFK/FAK信號也可通過維持AKT和MAPK通路減弱奧希替尼在耐藥模型中的療效[46]。

MET和HER2擴增在臨床前期和臨床研究中均有報道。值得注意的是，HER擴增在使用奧希替尼進展的患者中似乎是相互獨立的[39-42]，而MET擴增則不是[33]。EGFR-TKI耐藥可觀察到MET擴增，MET和EGFR雙抑制可抑制小鼠模型的腫瘤生長[41,47]。據(jù)報道，使用奧希替尼進展的患者存在成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）擴增[43]?；颊吣[瘤組織中成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2, FGF2）mRNA水平大約高出20倍，表明存在FGF2-FGFR1自分泌環(huán)介導(dǎo)的耐藥。另一方面，PIK3CA突變（E545K）已被報道為奧希替尼的耐藥機制[48,49]，這個熱點突變是否對PI3K抑制劑敏感還有待進一步研究。同時發(fā)生的PIK3CA、PTEN和TP53等突變也見于小細胞轉(zhuǎn)化患者[50]。轉(zhuǎn)化為SCLC的腫瘤可能保留原有的EGFR激活突變，但未發(fā)現(xiàn)T790M。已知視網(wǎng)膜母細胞瘤基因（retinoblastoma 1,RB1）的缺失也與SCLC的轉(zhuǎn)化有關(guān)[12,43]。

RAS-MAPK通路激活與KRAS突變、KRAS擴增、BRAF、NRAS和MEK1突變相關(guān)，以上均被報道為奧希替尼獲得性耐藥機制[35,42,48,49,51]。KRAS突變包括G12S、G12A、Q61H、G12D和A146T位點。在臨床前期模型中，奧希替尼可識別NRAS突變（E63K）或NRAS拷貝數(shù)增加[51]。值得注意的是，耐藥細胞系對MEK抑制劑、司美替尼和EGFR-TKI的組合表現(xiàn)出敏感性。也有報道[44,49]認為BRAF突變（V600E）為奧希替尼的耐藥機制之一。恩考芬尼（BRAF抑制劑）和奧希替尼的組合對耐藥細胞系表現(xiàn)出敏感性[44]。

在組織學(xué)改變方面，在EGFR-TKIs治療期間或之后，一部分患者（5%-10%）發(fā)生了NSCLC向SCLC的組織學(xué)轉(zhuǎn)化[52]。轉(zhuǎn)化為SCLC的機制基礎(chǔ)在很大程度上仍未明確，但可能與RB缺失有關(guān)[53]。RB缺乏本身在SCLC中很常見，初步認為NSCLC中EGFR的慢性抑制導(dǎo)致了SCLC的遺傳、組織學(xué)和藥物敏感性的表現(xiàn)。小細胞轉(zhuǎn)化也與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）程序相關(guān)，E-cadherin低表達和波形蛋白表達升高就是證明[52]。EMT也可能是由AXL激酶[54]、TGF或Notch-1的激活引起的[55,56]。轉(zhuǎn)化為SCLC的腫瘤可能保留原有的EGFR激活突變，但未發(fā)現(xiàn)T790M。同時發(fā)生的PIK3CA、PTEN和TP53等突變也見于小細胞轉(zhuǎn)化患者[57]。

5 未來的視角和總結(jié)

隨著EGFR靶向治療藥物的不斷增加，治療EGFR突變型晚期NSCLC的最佳順序成為了一個重要問題。在T790M突變患者中，奧希替尼優(yōu)于化療。在最近發(fā)表的FLAURA試驗中，奧希替尼與吉非替尼（NCT02296125）的III期研究中闡明與第一代EGFR-TKI相比，奧希替尼顯示出更好的PFS和更少的毒性。此外，它也被證明對CNS轉(zhuǎn)移患者有效[58]。2019年8月31日奧希替尼獲批為一線治療EGFR敏感性突變。T790M耐藥突變的檢測方式以組織學(xué)為金標準，由于客觀原因無法獲得組織學(xué)標本可以用血漿檢測進行嘗試，血漿ctDNA檢測的出現(xiàn)和臨床驗證為追蹤患者腫瘤的動態(tài)基因組演變提供了可能。血液檢測在某些方面解決了部分患者的腫瘤異質(zhì)性問題，但是如何提高檢測的敏感性和特異性仍是目前存在的挑戰(zhàn)。三代EGFR-TKI的獲得性耐藥機制主要包括兩個方面：依賴于EGFR的機制和非依賴機制。依賴于EGFR的機制最主要的是EGFRC797S突變的發(fā)生，順式突變和反式突變是C797S與T790M突變共同存在的兩種形式。非依賴機制包括MET擴增、HER-2和FGFR、MAPK激活、KRAS突變、PI3KCA、BRAF、PTEN缺失和SCLC轉(zhuǎn)化等。三代EGFR-TKI耐藥后精準的檢測技術(shù)是尋找臨床應(yīng)對策略的基礎(chǔ)。

未來十年的熱點將繼續(xù)集中于第三代EGFR-TKIs耐藥機制研究，這將對臨床全程管理NSCLC起到重要作用，并對開發(fā)新一代治療和合理聯(lián)合用藥策略以克服EGFR-TKI耐藥起到至關(guān)重要的作用和理論依據(jù)。