熱打擊誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體特征及其功能分析

陳懷生，張明，梁泳欣，施學(xué)智，童華生*，蘇磊

1深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 518020；2廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一區(qū)，廣東清遠(yuǎn) 511500；3解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/解放軍熱區(qū)損傷與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 518020

既往研究發(fā)現(xiàn)，熱浪與重癥中暑病死率呈正相關(guān)[1]。隨著極端氣候的出現(xiàn)，重癥中暑發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)中暑病死率為10%～15%，而重癥中暑病死率更高。重癥中暑常表現(xiàn)為中心體溫升高超過(guò)40 ℃及以嚴(yán)重凝血功能障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為主的多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[3]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在重癥中暑凝血功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]：一方面血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可促進(jìn)炎性因子的釋放，另一方面則啟動(dòng)凝血功能紊亂。兩者相互影響，進(jìn)而導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intra-vascular coagulation，DIC)及微血栓的形成，并進(jìn)展為MODS[5]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，旁分泌途徑在炎癥反應(yīng)過(guò)程中扮演著重要角色。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)為19～25個(gè)核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[6]，能夠與靶基因的mRNA部分或完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，對(duì)多種靶基因的表達(dá)起調(diào)控作用，從而參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[7]。血清中的miRNA主要存在于外泌體中。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，由細(xì)胞釋放進(jìn)入血清，發(fā)揮旁分泌作用。本研究分析人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)受熱打擊后釋放的外泌體的特征及其對(duì)細(xì)胞生物行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HUVECs購(gòu)自中科院上海細(xì)胞中心；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀(ZetaView PMX 110)購(gòu)自德國(guó)PMX公司；聚苯乙烯顆粒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CD63和TSG101一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CD63和TSG101二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 HUVECs用含10%胎牛血清、10萬(wàn)U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)夜饑餓同步化處理后，將HUVECs分為對(duì)照組與熱打擊組。熱打擊組細(xì)胞給予41 ℃熱刺激培養(yǎng)2 h，建立熱打擊細(xì)胞模型；對(duì)照組細(xì)胞于37 ℃孵育培養(yǎng)2 h。

1.3 外泌體特征鑒定

1.3.1 外泌體提取 在提取外泌體之前，先將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，并進(jìn)行過(guò)夜饑餓處理。收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，500×g離心10 min，去除細(xì)胞沉淀；2000×g離心10 min，去除細(xì)胞碎片；用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集上清；100 000×g超速離心4 h，收集沉淀并用少量PBS重懸，100 000×g離心70 min，得到的沉淀即為外泌體。

1.3.2 納米顆粒追蹤分析法(NTA)檢測(cè)外泌體的粒徑及濃度 將外泌體樣品用PBS稀釋至(3～5)×107顆粒/ml，采用ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀(ZetaView PMX 110)及直徑110 nm的聚苯乙烯顆粒校準(zhǔn)，用去離子水清洗樣本池，將樣品上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)溫度為23 ℃，用ZetaView 8.04.02 SP2軟件分析外泌體濃度及粒徑分布。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101的表達(dá) 在外泌體樣品中加入上樣緩沖液，使蛋白變性，然后用10% SDS-PAGE分離(200 mA)，2 h后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入CD63和TSG101一抗(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜，5% TBST洗膜3次；加入二抗(1:3000)室溫孵育1 h，5% TBST洗膜3次，采用化學(xué)發(fā)光液顯色。

1.3.4 外泌體進(jìn)入細(xì)胞情況觀察 將適量Dil染料加入外泌體樣品中，避光染色20 min；經(jīng)外泌體染色濾柱去除多余染料，然后加入正常HUVECs中培養(yǎng)24 h，用4%甲醛固定，熒光顯微鏡下觀察外泌體進(jìn)入細(xì)胞的情況。

1.4 外泌體干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、37 ℃外泌體處理組及41 ℃外泌體處理組。空白對(duì)照組細(xì)胞于37 ℃溫育培養(yǎng)，37 ℃外泌體處理組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入對(duì)照組細(xì)胞釋放的外泌體共培養(yǎng)，41 ℃外泌體處理組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入熱打擊組細(xì)胞釋放的外泌體共培養(yǎng)，檢測(cè)外泌體對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及凝血功能指標(biāo)的影響。

1.4.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況 加入PBS制成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清；加入70%乙醇2 ml，4 ℃下離心3 min，棄上清；加入含RNase A的PBS溶液(20 mg/ml) 500 ml，37 ℃下離心30 min，棄上清；加入含PI的PBS溶液(50 mg/ml) 500 ml，室溫避光孵育30 min；吹打混勻，300目篩網(wǎng)過(guò)濾至流式管中，4 ℃保存，在流式細(xì)胞儀器中檢測(cè)細(xì)胞周期并收集數(shù)據(jù)。

細(xì)胞懸液采用預(yù)冷的PBS液洗滌，加入300 ml 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，5 ml Annexin V-FTTC與之混合均勻，室溫下避光孵育15 min，加入5 ml PI染色液，5 min后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板中孵育過(guò)夜，吸盡培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，吸盡培養(yǎng)液，每孔加入100 μl CCK-8工作液(DMEM培養(yǎng)基:CCK-8=9:1)，孵育60 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值。

1.4.3 ELISA法檢測(cè)組織因子(TF)、血管性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)和組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)的含量 收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，加樣體系為100 μl，封板膜封板，室溫孵育1 h，洗滌5次，拍干；加入酶標(biāo)試劑100 μl/孔(空白孔除外)，室溫孵育1 h，洗滌5次，拍干；加入顯色劑100 μl/孔，輕輕震蕩混勻，室溫避光顯色15 min；加入終止液100 μl/孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.5 高通量測(cè)序分析外泌體中的miRNA 提取樣品總RNA，用PAGE膠分離回收18～30 nt的小RNA。在5'接頭連體系混勻離心，充分反應(yīng)，用PAGE膠純化回收5'連接產(chǎn)物；在3'接頭連體系混勻離心，充分反應(yīng)，用PAGE膠純化回收3'連接產(chǎn)物，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，通過(guò)PCR擴(kuò)增，再用PAGE膠回收純化。構(gòu)建好的文庫(kù)采用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System Time進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè)。將測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，獲得clean tags(原始序列數(shù)據(jù)去除雜質(zhì)后獲得的數(shù)據(jù))。通過(guò)比對(duì)不同數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該tags進(jìn)行注釋(miRNA、rRNA、tRNA、snRNA、exon、intron等)。將匹配上基因組的tags進(jìn)行新miRNAs預(yù)測(cè)，結(jié)合比對(duì)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已知miRNA的定量分析、差異分析，以及基于差異miRNAs的后續(xù)分析(包括差異miRNAs的聚類分析、靶基因分析和靶基因的功能富集分析等)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的特征 NTA檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞釋放的外泌體大小存在差異。對(duì)照組細(xì)胞釋放的外泌體直徑為150 nm，濃度為5.37×108顆粒/ml；熱打擊組細(xì)胞釋放的外泌體直徑為152 nm，濃度為5.34×108顆粒/ml(圖1A)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與37 ℃熱打擊外泌體比較，41 ℃熱打擊HUVECs外泌體中標(biāo)志蛋白CD63表達(dá)減少，TSG101表達(dá)增加(圖1B)。將熒光染料標(biāo)記的熱打擊組細(xì)胞釋放的外泌體與正常細(xì)胞共孵育，可見外泌體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖1C)。

2.2 外泌體對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，37 ℃外泌體處理組細(xì)胞周期與空白對(duì)照組相似(圖2A、B)；41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體增加了G2期的細(xì)胞數(shù)量(圖2C)。37 ℃外泌體處理組細(xì)胞凋亡情況與空白對(duì)照組相似(圖3A、B)；41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖3C)。

2.3 外泌體對(duì)細(xì)胞增殖及對(duì)凝血功能指標(biāo)的影響 MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和37 ℃外泌體處理組比較，41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體明顯抑制了正常細(xì)胞的增殖活性(P＜0.05，圖4A)。與空白對(duì)照組比較，37 ℃外泌體處理組TF、vWF、PAI-1的表達(dá)增加，t-PA表達(dá)降低(P＜0.05)；與37 ℃外泌體處理組比較，41 ℃外泌體處理組TF、vWF、PAI-1的表達(dá)明顯增加，t-PA表達(dá)明顯降低(P＜0.01，圖4B)。

2.4 外泌體中miRNA分析 高通量測(cè)序結(jié)果顯示，與37 ℃孵育HUVECs比較，41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體共出現(xiàn)2590條miRNA調(diào)節(jié)變化。差異miRNAs的聚類分析結(jié)果顯示，37 ℃孵育與41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體中miRNAs的表達(dá)存在明顯差異，其中表達(dá)量及表達(dá)差異最高的miRNA熱圖如圖5A所示。與37 ℃孵育HUVECs釋放的外泌體比較，41 ℃熱打擊后HUVECs釋放的外泌體中經(jīng)測(cè)序共發(fā)現(xiàn)2002條表達(dá)上調(diào)的miRNA和588條表達(dá)下調(diào)的miRNA，其中有493條上調(diào)的miRNA與412條下調(diào)的miRNA，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中60條miRNA的上調(diào)和下調(diào)具有1倍以上的倍數(shù)關(guān)系。miRNA靶基因GO和Pathway分析結(jié)果顯示，41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體中miRNA與凋亡相關(guān)通路有關(guān)，并結(jié)合泛素樣蛋白、泛素蛋白等(圖5B、C)。

3 討 論

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體的特征鑒定Fig.1 Characterization of exosomes

圖2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of exosomes on HUVECs cell cycle

圖3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of exosomes on HUVECs apoptosis

圖4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)細(xì)胞增殖及凝血功能指標(biāo)的影響Fig.4 Effects of exosomes on the proliferation and coagulation of HUVECs

圖5 37 ℃孵育和41 ℃熱打擊HUVECs釋放外泌體的miRNA比較Fig.5 Comparison of microRNAs in exosomes released from HUVECs by incubation at 37 ℃ and heat shock at 41 ℃

極端炎熱天氣會(huì)導(dǎo)致病死率升高[8]，且重癥中暑可導(dǎo)致更高的病死率。極熱期間，美國(guó)城鎮(zhèn)地區(qū)中暑發(fā)生率約為20/10萬(wàn)人，潛在病死率高達(dá)10%～70%[9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是中暑后機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、凝血功能障礙的主要原因。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，受到熱打擊后，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放外泌體的濃度發(fā)生改變，且能被共同孵育的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞吞入胞內(nèi)，改變了細(xì)胞的行為。41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體能夠抑制正常血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活力。

重癥中暑可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致凝血功能障礙。本研究結(jié)果顯示，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞與41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體共同孵育后，其TF、vWF、PAI-1的表達(dá)增加，t-PA表達(dá)降低。TF是連結(jié)炎癥與凝血功能紊亂的因子[10]，既往研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑狒狒表現(xiàn)出明顯的凝血功能紊亂及血栓形成，血栓中存在TF，且循環(huán)中TF水平增高與微血管廣泛血栓的形成具有明顯相關(guān)性，提示重癥中暑所致的血栓可能主要為免疫血栓，且與TF關(guān)系較大[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，將41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體加入正常HUVECs中共同孵育后，可以促進(jìn)HUVECs釋放TF，并引起下游的凝血相關(guān)指標(biāo)(包括vWF、PAI-1、t-PA等)發(fā)生變化。vWF可同時(shí)結(jié)合血小板及血管內(nèi)皮下膠原纖維，將血小板黏附于血管壁，導(dǎo)致血栓形成；PAI-1能夠抑制已經(jīng)形成的纖維蛋白原溶解，對(duì)血栓形成具有促進(jìn)作用；t-PA是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌、釋放的蛋白，能夠親和纖維蛋白，并使酪氨酸纖溶酶原形成纖溶酶，降解纖維蛋白原[11]。本研究結(jié)果表明，41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體能夠抑制正常HUVECs分泌t-PA，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，影響凝血因子的釋放，最終起到促凝的作用。

本研究結(jié)果顯示，41 ℃熱打擊HUVECs釋放的外泌體中包含多種miRNAs，上調(diào)的miRNAs預(yù)測(cè)與凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，增加p53的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[12]。p53等蛋白表達(dá)增加可導(dǎo)致熱打擊后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加[13]。SIRT1激動(dòng)劑能夠改善和促進(jìn)p53的表達(dá)，抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，以及抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)分子，而SIRT1抑制劑能夠阻抑這種作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。通常MAPK9與MAPK8可共同抑制p53泛素化、穩(wěn)定p53而誘導(dǎo)凋亡，MAPK10則能夠激活MAPK8/JNK系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用[15]。Bcl-2為凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子，可抑制細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放，從而抑制超氧化陰離子的產(chǎn)生；還可增加胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑的含量，升高NAD/NADH比值，降低凋亡相關(guān)的GSH，促進(jìn)GSH進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。本研究預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，抑制凋亡基因的miRNAs亦上調(diào)，表明熱打擊所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程受促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的雙重作用，而在熱打擊細(xì)胞模型中，Bcl-2蛋白可能并未起到保護(hù)細(xì)胞、抑制凋亡的作用。此外，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，能夠產(chǎn)生PIP2和PIP3，Akt則是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的下游靶點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號(hào)刺激時(shí)，PI3K活化產(chǎn)生的PIP3和Akt N端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt向質(zhì)膜轉(zhuǎn)位而激活，后者催化其自身的Ser124和Thr450磷酸化，同時(shí)使PIP3依賴激酶(PDK1、PDK2)分別催化Akt的Thr308和Ser473磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)kt，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。PI3K/Akt信號(hào)通路具有抗凋亡和促凋亡的雙重作用。PI3K/Akt直接調(diào)控Bcl-2蛋白家族，使Bad蛋白的Ser136磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡[18]。激活的Akt能促進(jìn)Ser196磷酸化，滅活caspase-9[19]，抑制GSK-3B酶的活性，發(fā)揮抗凋亡的作用[20]。PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過(guò)間接調(diào)控鼠雙微粒體2(Mdm2)，抑制p53的活性[21]；還可通過(guò)促進(jìn)CREB蛋白活性，增強(qiáng)Bcl-2的功能[22]，磷酸化FOXO蛋白亞型，降低轉(zhuǎn)錄因子活性，起抑制凋亡的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌途徑在細(xì)胞損傷中起重要作用。旁分泌途徑是指由細(xì)胞分泌的有功能的細(xì)胞因子或外泌體對(duì)附近甚至遠(yuǎn)處的器官、細(xì)胞造成影響。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌是導(dǎo)致炎癥、凝血功能異常的重要途徑，且與血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)[23]。本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體與健康人體溫度(37 ℃)下細(xì)胞釋放的外泌體形態(tài)存在差異，并且能夠改變正常細(xì)胞的細(xì)胞周期、活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并對(duì)凝血功能造成影響，提示旁分泌途徑可用于疾病治療。最近研究發(fā)現(xiàn)，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌機(jī)制能夠改善心肌缺血/再灌注損傷[24]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠釋放生長(zhǎng)因子，可利用其旁分泌途徑對(duì)低氧、糖尿病患者的視網(wǎng)膜進(jìn)行修復(fù)[25]。外泌體源性miRNA也可通過(guò)旁分泌途徑對(duì)器官功能造成影響。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在豬心肌梗死、心力衰竭模型中，由心臟基質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體中過(guò)表達(dá)的miR-21-5p能夠修復(fù)心肌細(xì)胞[26]。

本研究未涉及外泌體中的miRNA，但外泌體源性miRNA必然起到了重要作用，進(jìn)一步深入探討外泌體的作用機(jī)制必然要探討這些miRNA所發(fā)揮的作用。外泌體中包含的miRNA數(shù)量巨大，因此先從外泌體的功能入手研究，能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)有價(jià)值的miRNA指明方向。

綜上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞受41 ℃熱打擊損傷后可釋放異常外泌體，后者可導(dǎo)致正常HUVECs細(xì)胞行為、功能異常，TF釋放增加，同時(shí)促凝因子釋放增加、抗凝因子釋放減少，從細(xì)胞學(xué)上解釋了熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥及免疫血栓形成的機(jī)制。