CD200調(diào)節(jié)重癥中暑大鼠肺部炎癥反應的信號通路初探

陳榮琳，曹楓，符少平，彭懷力，施學智，梁泳欣，童華生*

1深圳市龍崗中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，深圳 518116；2解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學科/解放軍熱區(qū)損傷與組織修復重點實驗室，廣州 5100010

重癥中暑是由于熱的直接細胞毒性或血管內(nèi)皮損傷觸發(fā)炎性細胞因子釋放，引起的熱相關全身炎癥反應，進而導致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1-4]。某些炎性因子是重癥中暑炎癥反應和MODS病理生理過程中的重要節(jié)點[5-6]。白細胞分化抗原CD200及其受體CD200R信號通路在抑制炎性細胞活化、下調(diào)炎性因子分泌和減輕炎癥方面發(fā)揮作用[7-8]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，CD200/CD200R在熱打擊誘發(fā)的促炎細胞因子分泌與釋放中發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用[9-10]，但其分子機制尚不清楚。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在轉錄水平參與多種炎性因子表達的調(diào)控[11-12]，其活性受CD200調(diào)節(jié)[13-14]。本研究以CD200融合蛋白預處理重癥中暑大鼠，觀察大鼠肺組織中NF-κB/p65 mRNA的表達，檢測血清高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素6(interleukin 6，IL-6)水平，初步探索CD200抑制重癥中暑炎癥反應的分子機制，為重癥中暑的有效救治提供可能的候選靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ELISA雙抗夾心法試劑盒購自日本SHINO-TEST公司，NF-κB/p65購自美國Thermo Scientific公司，CD200融合蛋白購自美國R&D Systems公司。

1.2 實驗動物及分組 鑒于雌激素對重癥中暑機體可能的保護作用[15]，本實驗選用雄性Wistar大鼠為研究對象。健康成年大鼠40只，體重220～260 g，購于南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(粵)2014-0100。實驗大鼠依隨機數(shù)字表法分為對照組(n=8)、重癥中暑組(HS組，n=16)、CD200預處理組(CD200組，n=16)。對照組常規(guī)飼養(yǎng)于溫度(22.0±1.0) ℃、濕度35%±5%環(huán)境；HS組和CD200組分別經(jīng)尾靜脈注射100 μl生理鹽水和等體積CD200融合蛋白(1000 μg/ml)[16]，2 h后經(jīng)熱打擊制備重癥中暑模型。本研究實驗流程經(jīng)院倫理委員會審核通過。

1.3 重癥中暑大鼠模型制備 參照本課題組前期方法[17]，在大鼠股動脈內(nèi)放入24G套管針接壓力轉換器以持續(xù)監(jiān)測大鼠動脈血壓，肛門約4 cm深度處放入溫度探頭以記錄直腸內(nèi)溫度；然后將大鼠置于人工氣候艙[溫度(40±2) ℃，濕度65%±5%]。重癥中暑模型制備成功標準：持續(xù)熱打擊狀態(tài)下，直腸溫度(即核心體溫)達42 ℃以上，平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)降低。HS組和CD200組中的8只大鼠經(jīng)受持續(xù)熱打擊至死亡，用于存活時間測定；其他大鼠在重癥中暑發(fā)生后60 min注射大劑量戊巴比妥鈉處死，即刻心臟采血5 ml，用于血清HMGB1、TNF-α、IL-6水平檢測；取左肺組織用于NF-κB/p65 mRNA表達水平檢測，右肺組織行病理形態(tài)學觀察。

1.4 大鼠肺組織NF-κB/p65 mRNA表達檢測以β-actin為內(nèi)參，采用反轉錄PCR法測定。提取肺組織總RNA，反轉錄為cDNA。NF-κB/p65引物:正義5'-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3'，反義5'-TGGTCCCGTGAAATACACCT-3'，擴增片段長度為281 bp。PCR條件：96 ℃ 4 min，然后94 ℃ 30 s、58 ℃30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用Image J 2.1.4.7分析電泳條帶灰度值，計算目的基因與內(nèi)參的比值。

1.5 大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6水平測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，按照試劑盒說明書操作，測定樣本在450 nm處的光密度值，以計算樣品濃度。

1.6 大鼠肺組織病理形態(tài)分析 制備實驗大鼠完整右肺病理切片，將切片隨機編碼，經(jīng)HE染色后，在光學顯微鏡下進行盲法病理損傷計分。計分參照Hang等[18]的標準。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，各組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 重癥中暑大鼠肺組織NF-κB/p65 mRNA表達如圖1所示，HS組NF-κB/p65 mRNA相對表達水平最高，為0.43±0.18，CD200組和對照組的相對表達水平分別為0.36±0.13、0.24±0.14。其中HS組、CD200組NF-κB/p65 mRNA表達水平明顯高于對照組，且HS組明顯高于CD200組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 重癥中暑大鼠血清炎性細胞因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平 HS組和CD200組血清HMGB1、TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組(P＜0.05)，且HS組明顯高于CD200組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

圖1 各組大鼠肺組織NF-κB/p65 mRNA的表達Fig.1 Expression of NF-κB/p65 mRNA in lung tissue of rats

表1 各組大鼠血清炎性細胞因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平(，n=8)Tab.1 Levels of serum inflammatory cytokines HMGB1,TNF-α and IL-6 in rats (, n=8)

表1 各組大鼠血清炎性細胞因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平(，n=8)Tab.1 Levels of serum inflammatory cytokines HMGB1,TNF-α and IL-6 in rats (, n=8)

HS.重癥中暑；HMGB1.血清高遷移率族蛋白B1；TNF-α.腫瘤壞死因子α；IL-6.白介素6；與對照組比較，(1)P＜0.05；與HS組比較，(2)P＜0.05。

指標 對照組 HS組 CD200組HMGB1(pg/ml) 5.27±2.31 42.63±18.51(1)34.12±10.01(1)(2)TNF-α(ng/ml) 19.32±8.82138.58±50.89(1)63.54±25.25(1)(2)IL-6(ng/ml) 7.25±2.28115.65±40.15(1)51.08±15.08(1)(2)

2.3 重癥中暑大鼠存活時間 HS組大鼠中位存活時間為(81.4±18.3) min(95%CI 78.7～84.5)，CD200組中位存活時間為(98.4±21.6) min(95%CI 89.7～112.8)，兩組存活時間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

2.4 重癥中暑大鼠肺部病理形態(tài) 重癥中暑大鼠肺組織存在明確的炎癥損傷，肺泡塌陷，肺血管充血、間質(zhì)增厚，肺泡及間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯；CD200組肺泡炎性病變較重癥中暑組輕，部分肺泡結構仍能見到，炎癥及肺泡滲出現(xiàn)象弱于重癥中暑組(圖3)。對照組、HS組、CD200組肺病理損傷計分分別為0.6±0.5、19.3±4.5、16.8±3.6，其中HS組、CD200組明顯高于對照組，且HS組明顯高于CD200組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 重癥中暑大鼠Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of severe heatstroke rats

圖3 各組中暑大鼠肺部病理形態(tài)學變化(HE ×400)Fig.3 Pathological changes of lung in rats with severe heatstroke (HE ×400)

3 討 論

目前認為重癥中暑是由炎癥趨化因子、炎性細胞因子參與的涉及內(nèi)皮細胞、白細胞和上皮細胞的應激反應，可導致機體炎癥反應調(diào)節(jié)異常，觸發(fā)大量炎性細胞因子和HMGB1釋放，白細胞和內(nèi)皮細胞過度活化[19-20]，最終引發(fā)MODS。研究表明，約84%的重癥中暑患者符合全身炎癥反應的診斷標準，近75%的重癥中暑患者同時符合MODS，其中肺臟是最易受打擊器官之一[3]。本課題組前期在關于重癥中暑MODS的系列研究中發(fā)現(xiàn)，熱應激后，血漿中HMGB1、TNF-α和IL-6等炎性因子水平顯著升高，并進一步啟動全身炎癥反應，導致機體多個臟器功能嚴重損害；其血清水平與重癥中暑的病情密切相關[5,17,21-22]。本研究也進一步證實重癥中暑時血清炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平升高，因此，阻斷炎性細胞活化成為防治重癥中暑研究中的重要課題。白細胞分化抗原CD200及其受體CD200R參與的CD200/CD200R通路是阻抑全身炎癥反應的重要分子機制。CD200在炎癥損傷后的肺臟中廣泛分布，可與炎性細胞表面的特異性受體CD200R結合后，通過調(diào)節(jié)下游細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38通路，減少炎性因子的分泌；注射CD200融合蛋白可以減輕小鼠炎性細胞浸潤，顯著減少炎性因子干擾素(interferons，INF-γ)、TNF的釋放[5-6,21]。CD200/CD200R也參與了重癥中暑的炎癥反應過程[9-10]，在重癥中暑時呈低水平表達，CD200 mRNA水平與促炎因子HMGB1、TNF-α、IL-6分泌水平呈負相關關系。本研究發(fā)現(xiàn)，CD200融合蛋白預處理的重癥中暑大鼠血清炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平降低，大鼠生存時間等預后指標明顯改善，病理形態(tài)方面可見肺組織炎癥及肺泡滲出明顯減輕，初步證實CD200預處理對減緩重癥中暑大鼠炎癥反應具有一定的生物學作用。

NF-κB主要介導機體免疫和炎性因子表達調(diào)控[11]，參與感染、炎癥反應和腫瘤等病理過程及細胞周期調(diào)控等[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中暑后腸道細菌內(nèi)毒素移位，激活內(nèi)皮細胞NF-κB信號通路，促使炎性細胞因子表達[12]。NF-κB信號通路也參與CD200對炎癥反應的調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)，CD200融合蛋白預處理可降低香煙煙霧提取物誘導的小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應[13]，并通過調(diào)節(jié)NF-κB活性降低促炎因子IL-1β、IL-6和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的分泌[14]。本研究中CD200融合蛋白預處理致重癥中暑大鼠肺組織NF-κB/p65 mRNA表達降低，血清炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-6水平亦明顯降低，提示CD200預處理可以減輕重癥中暑大鼠炎癥反應，這一作用可能與NF-κB信號通路有關。