12C6+離子束誘變選育溫度耐受螺旋藻高產(chǎn)藻株及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王麗娟 鄭天翔 楊宋琪 李 欣 羅光宏

1（河西學(xué)院甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心 張掖734000）

2（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院 張掖734000）

3（甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室 張掖734000）

4（中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州730000）

螺旋藻（Spirulina sp.）是一種原核生物，屬于藍(lán)藻門（Cyanophyta）藍(lán)藻綱（Cyanobacteria）顫藻科（Oscillatoriaceae）螺旋藻屬（Spirulina）。由于含有豐富的蛋白質(zhì)和一些高附加值產(chǎn)物，而具有較高的經(jīng)濟價值［1］。目前，螺旋藻的應(yīng)用已從保健食品擴大到食品添加劑、醫(yī)藥、飼料和化妝品等領(lǐng)域。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸擴大，篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的螺旋藻品系越來越受到關(guān)注。但其產(chǎn)量和質(zhì)量不僅受培養(yǎng)條件的影響，還受地區(qū)和環(huán)境因素的制約?，F(xiàn)有的螺旋藻品系一個是非洲Chad湖鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），另一個是美洲墨西哥Sosa Texcoco 湖極大螺旋藻（Spirulina mxamia）。這兩個藻種屬于耐高溫品系，對溫度的耐受性與原產(chǎn)地的溫度接近，這也是我國螺旋藻養(yǎng)殖區(qū)域主要分布在南方沿海地區(qū)的主要原因。而甘肅張掖位于我國西北部河西走廊中段，屬于大陸性氣候，氣溫年變化較大，冬冷夏熱，螺旋藻的養(yǎng)殖期普遍較短，容易造成設(shè)備浪費。因此，為了提高生產(chǎn)周期和產(chǎn)量，探索適合本地區(qū)溫度生長繁殖的藻株有重要意義。目前，國內(nèi)外學(xué)者采用馴化、自然選擇、物理誘變、化學(xué)誘變和太空誘變育種方式選育出了許多新的螺旋藻藻株［2-7］，但采用碳離子輻照誘變螺旋藻的研究尚未見相關(guān)報道。

碳離子誘變育種與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變法相比，具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳相對穩(wěn)定等特點，已經(jīng)在微生物以及植物誘變育種中取得了巨大的經(jīng)濟效益與社會效益［8-10］。近幾年，在微藻誘變育種中的應(yīng)用也越來越多，如王芝瑤等［11］利用12C6+離子束對微擬球藻進(jìn)行誘變育種，獲得了兩株高生長速率和高油脂產(chǎn)率的突變株。李悅明等［12］對微擬球藻進(jìn)行了12C6+離子束輻照聯(lián)合三氯生誘變選育，獲得了一種具有較高二十碳五烯酸產(chǎn)量的微擬球藻突變株。王潔［13］研究了12C6+離子束對四尾柵藻光合系統(tǒng)的影響以及誘變機理，并篩選得到了光合能力較弱和耐高光的四尾柵藻藻株。

本研究利用12C6+離子束對螺旋藻進(jìn)行誘變處理，確定致死率；采用平板分離和溫度選育對大量突變株進(jìn)行初篩，結(jié)合生物量和遺傳穩(wěn)定性等因素篩選溫度耐受突變株，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索螺旋藻優(yōu)良藻種選育的新途徑，并為其進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

極大螺旋藻（Spirulina maxima）由甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心提供。培養(yǎng)基為Zarrouk 培養(yǎng)基。配方如下：NaHCO316.80 g/L、NaCl 1.00 g/L、NaNO32.50 g/L、K2SO41.00 g/L、K2HPO40.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、乙二胺四乙酸0.08 g/L、A51.00 g/L、B61.00 g/L，調(diào)整pH 為9.0。固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。培養(yǎng)溫度30 ℃，光暗比12∶12 h，光照強度60 μmol/(m2·s)。（注： A5， H3BO32.86 g/L、MnCl2·4H2O 1.80 g/L、 ZnSO4·7H2O 0.22 g/L、MoO30.01 g/L、CuSO4·5H2O 0.08 g/L；B6，NH4VO322.90 mg/L、 NiSO3·7H2O 47.80 mg/L、 NaWO417.90 mg/L、Ti(SO4)240.00 mg/L、Co(NO3)2·6H2O 4.40 mg/L）。

1.2 方法

1.2.112C16+離子束輻照誘變

取對數(shù)生長期的螺旋藻藻液1.5 mL，藻細(xì)胞初始OD560值（溶液在560 nm波長處的吸光值）為0.10，置于無菌平皿中，利用中國科學(xué)院現(xiàn)代物理研究所蘭州重離子加速器國家重點實驗室提供的12C6+離子束對螺旋藻進(jìn)行輻照處理，劑量率為80 Gy/min，劑量為0 Gy、200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy。其中0 Gy為對照組。

1.2.2 致死率的測定

將對照組與不同劑量輻照后的藻液梯度稀釋，吸取0.2 mL 藻液均勻涂布于螺旋藻固體平板培養(yǎng)基上，用封口膜封好，倒置培養(yǎng)，每組做3 個重復(fù)。在30 ℃下培養(yǎng)21 d，用公式（1）［14］計算致死率（%）。

1.2.3 溫度耐受突變株的篩選

將輻照后的藻液梯度稀釋，并在無菌條件下吸取輻照后的藻液0.1 mL 均勻涂布于螺旋藻固體平板培養(yǎng)基上，分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃培養(yǎng)，光照強度為60 μmol/(m2·s)，光暗比為12∶12 h。對不同溫度培養(yǎng)下生長迅速的螺旋藻藻株進(jìn)行取樣，置于96 孔板中進(jìn)行單株培養(yǎng)。并用酶標(biāo)儀測定其OD560值。當(dāng)藻液OD560≥0.60時，采用體視鏡單管移液器挑選分離方法，從螺旋藻培養(yǎng)液中吸取少量帶有藻絲體的藻液進(jìn)行稀釋，取稀釋后的藻液置于單凹片上，在低倍鏡下觀察藻絲體，同時選取單株目標(biāo)藻絲體進(jìn)行培養(yǎng)。重復(fù)上述單株分離選育步驟，直至每一株系形態(tài)穩(wěn)定。最后培養(yǎng)10 d 后測定生物量，對生物量提高10%的突變株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 溫度耐受突變株的穩(wěn)定性測定

將篩選得到的螺旋藻突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，測定其生物量，以檢測突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 突變株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將培養(yǎng)至對數(shù)期的溫度耐受突變株接種至Zarrouk 培養(yǎng)基中，并在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 d，藻細(xì)胞初始接種濃度OD560為0.20±0.02。在最佳耐受溫度下（Sm04#和Sm21#培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃），采用單變量原則分別考察不同pH（7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、不 同 光 照 強 度（40 μmol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)、100 μmol/(m2·s)）和 不 同 光 暗 比（8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h、16∶8 h）對生物量的影響。

1.2.6 測定方法

生物量的測定：取一定體積藻液，用混合纖維濾膜（0.45 μm）真空抽濾，于105 ℃烘箱中烘至恒重，見公式（2）。

式中：WD表示單位體積藻體的干重（g/L）；W1為混合纖維濾膜烘至恒重后的質(zhì)量（g）；W2為濾膜和藻樣烘至恒重后的總質(zhì)量（g）；V 為藻液體積（L）。

可溶性糖的測定：取20 mL藻液離心，藻泥加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.8），混勻后低溫超聲20 min，并于-80 ℃凍融循環(huán)3 次，離心后上清液用于測定螺旋藻可溶性糖，可溶性糖的測定采用硫酸蒽酮法。

蛋白質(zhì)的測定：采用凱氏定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 12C16+離子束輻照誘變致死率

輻照誘變螺旋藻致死率結(jié)果見圖1。由圖1 可知，在200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy時，致死率分別為38.32%、51.21%、71.84%、78.47%和94.58%。隨著吸收劑量的增加，致死率增大。根據(jù)誘變經(jīng)驗，致死率為70%～80%時，會產(chǎn)生較高的陽性突變率［15-16］。因此，本研究將劑量在600 Gy 和800 Gy 輻照下的藻株作為重點篩選對象。

2.2 溫度耐受突變株的篩選

對600 Gy 和800 Gy 輻照下的螺旋藻藻株通過不同溫度培養(yǎng)后初步篩選得到156株生長迅速的突變株，進(jìn)一步從這156株中篩選出2株生物量最高且遺傳穩(wěn)定的耐低溫和耐高溫的突變株。分別是經(jīng)600 Gy 輻照后20 ℃和800 Gy 輻照后35 ℃培養(yǎng)條件下的螺旋藻突變株Sm04#和Sm21#。對篩選得到的2株溫度耐受突變株進(jìn)行生長曲線測定，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)末期突變株Sm04#和Sm21#的生物量達(dá)到0.54 g/L 和0.91 g/L，較各自對照組分別提高了11.49%和12.64%，說明Sm04#和Sm21#是2 株優(yōu)勢明顯的耐低溫和耐高溫突變株。

2.3 不同pH對螺旋藻突變株生長的影響

在pH 分別為7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 和10.0條件下對突變株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，光照強度60 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12 h。每隔1 d 用酶標(biāo)儀測定藻液OD560，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，兩株突變株的最適pH均為9.0，pH為9.5次之，中性環(huán)境生長最慢。

2.4 不同光照強度對螺旋藻突變株生長的影響

在 光 照 強 度 值 分 別 為40 μ mol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)和100 μmol/(m2·s)條件下對突變株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，pH=9.0，光暗比12∶12 h，培養(yǎng)18 d 后測定藻液OD560，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，Sm04#和Sm21#的最適光強分別為70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)。

2.5 不同光暗比對螺旋藻突變株生長的影響

在光暗比分別為8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h 和16∶8 h 條 件 下 對 突 變 株Sm04#和Sm21#進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20 ℃和35 ℃，光照強度分別為70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)，pH=9.0，培養(yǎng)18 d 后測定藻液OD560，結(jié)果見圖5。由圖5可知，Sm04#和Sm21#的最適光暗周期分別為12∶12 h和14∶10 h。

2.6 突變株中蛋白質(zhì)和多糖含量特性

分別將螺旋藻突變株Sm04#和Sm21#在各自適宜的條件下進(jìn)行擴大培養(yǎng)，并測定其蛋白質(zhì)和可溶性糖含量，結(jié)果見表1。由表1 可知，在相同培養(yǎng)條件下，突變株Sm04#和Sm21#蛋白質(zhì)的含量分別為70.97%和69.31%，相比各自的對照組分別增加了5.06%和2.22%，而可溶性糖含量Sm04#和Sm21#相比于對照分別增加了5.77%和2.11%。

表1 突變株Sm04#和Sm21#中蛋白質(zhì)和多糖含量Table 1 Contents of protein and polysaccharide in the mutant strains Sm04#and Sm21#

3 討論與結(jié)論

重離子束對生物體的誘變效應(yīng)是將動量傳遞、能量和質(zhì)量沉積、電荷中和與交換融合在一起［17］，經(jīng)重離子輻照的細(xì)胞會生成活性氧簇（ROS），一般包括·O2-、·OH 和H2O2等。ROS 會通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致DNA 單雙鍵斷裂、蛋白質(zhì)變性、失活等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致其壞死。正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，ROS 濃度很低，不會引起傷害。但當(dāng)植物處于重離子輻照等逆境條件時，這種平衡會遭到破壞［18］。結(jié)果ROS 的濃度超過了傷害“閾值”，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸、酶結(jié)構(gòu)的氧化破壞，最后導(dǎo)致植物受傷害甚至死亡。本實驗中，細(xì)胞膜是藻體最先接觸輻照的部位，過多的活性氧會引起膜脂過氧化，而丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化分解的最終產(chǎn)物，是膜脂傷害程度的標(biāo)志。超氧化物歧化酶（SOD）能清除·O2-，可在一定范圍內(nèi)通過其調(diào)節(jié)使細(xì)胞免受毒害。王潔等［19］研究了重離子輻照對四尾柵藻MDA 和SOD 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量輻照時，MDA和SOD顯著上升后可恢復(fù)至正常水平；高劑量輻照時，MDA 和SOD 短期內(nèi)下降且不能恢復(fù)正常。說明重離子輻照對藻體有一定毒性，且有一定劑量效應(yīng)。在低劑量時，藻細(xì)胞能通過自我調(diào)節(jié)機制來增強抗氧化酶活性以增強其抗氧化和抵抗逆境的能力，從而減輕損傷，保證生理代謝的正常進(jìn)行。在較高劑量時，細(xì)胞維持較高的·O2-，胞內(nèi)的活性物質(zhì)包括酶會受到損傷，超出機體的耐受能力。這與重離子輻照對其他植物的影響結(jié)果一致［20-22］。

可溶性糖是反映植物抗逆性的指標(biāo)，不僅對細(xì)胞膜和原生質(zhì)體有一定的保護(hù)作用，還起到保護(hù)酶類的作用。植物體經(jīng)過重離子輻照后在生理上主要表現(xiàn)為可溶性糖含量的增加和生物體內(nèi)活性氧的增加［23］。本實驗中，突變株Sm04#和Sm21#可溶性糖含量都有所積累，并且Sm04#含量高于Sm21#。這可能是因為低劑量的輻照使藻株的染色體和細(xì)胞膜遭到破壞，促使細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)啟動，可溶性糖積累，增強了抵抗逆境的能力，從而維持機體的正常生理活動。而吸收劑量較高時，藻株的內(nèi)囊體膜受到嚴(yán)重?fù)p害，細(xì)胞所需的能量和有機物嚴(yán)重供給不足，從而影響了多糖的含量。這與王靜等［24］研究UV-B 對紫球藻的影響結(jié)果一致，即低劑量促進(jìn)，高劑量抑制。重離子輻照對其他植物的影響也有相似性，但不同植物的影響趨勢不盡相同［25-26］，可能與品種間的輻射敏感差異性有關(guān)。蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞內(nèi)的生命物質(zhì)，在細(xì)胞生命活動中起非常重要的作用，并且蛋白質(zhì)是親水性膠體，對膜的保護(hù)性大于可溶性糖。本實驗中，突變株Sm04#蛋白質(zhì)含量高于Sm21#。這可能是因為在600 Gy 時，藻細(xì)胞自我調(diào)節(jié)以抵抗逆境，激活了相關(guān)蛋白合成基因，合成大量的相關(guān)抗逆蛋白和酶，使蛋白質(zhì)含量增加，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化［22］。而吸收劑量增大時，推測可能是由于光合作用場所內(nèi)囊體逐漸溶解和消失，藍(lán)藻細(xì)胞色素的光能捕獲和傳遞能力降低，蛋白電子產(chǎn)率及傳遞速率也隨之降低，蛋白質(zhì)含量下降［27］。600 Gy 輻照處理后的可溶性糖和蛋白質(zhì)均有顯著增加，說明600 Gy 輻照處理能增加藻株的抗逆性。這對螺旋藻抗逆性的提高和新品種的選育具有重要意義。但藻株輻照后測定的生理生化指標(biāo)偏少，尤其在0～600 Gy 間的變化趨勢不夠詳盡，因此，重離子輻照對螺旋藻的抗逆性增強和新品種選育中的作用機理還有待進(jìn)一步研究。

通過12C6+離子束對螺旋藻進(jìn)行輻照，結(jié)合平板分離和溫度選育篩選出2 株溫度耐受株Sm04#和Sm21#，生物量達(dá)到0.54 g/L 和0.91 g/L，較對照組分別提高了11.49%和12.64%，并優(yōu)化了其培養(yǎng)條件。結(jié)果說明，對采用重離子束輻照聯(lián)合溫度選育的方法，可以獲得溫度耐受高產(chǎn)螺旋藻突變

株，但是否產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢明顯尚有待于室外大規(guī)模培養(yǎng)驗證。