循環(huán)血ANRIL在急性心肌梗死早期診斷中的價值

黃穎 張云 農(nóng)文政

[摘要] 目的 探討循環(huán)血ANRIL在急性心肌梗死（AMI）早期診斷中的價值。 方法 收集2016年11月～2018年6月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的50例AMI患者（實驗組）和30例冠脈造影正常者（對照組）的全血標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）在AMI癥狀發(fā)作后的不同時間段（0～6 h、12 h、24 h、7 d和14 d）檢測受試者循環(huán)血ANRIL水平，電化學(xué)發(fā)光法檢測血漿肌鈣蛋白T（cTnT）水平。 結(jié)果 兩組年齡、性別、吸煙、糖尿病、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、收縮壓、舒張壓、血肌酐（Cr）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。兩組cTnT水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與對照組比較，實驗組血漿中循環(huán)ANRIL和cTnT表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。實驗組循環(huán)血ANRIL表達水平在入院時即開始升高，在12 h達峰值之后有所下降，7 d時已降至正常范圍;cTnT具有相當(dāng)長的診斷窗口期，在6～12 h開始顯著上升，24 h達峰值后有所下降，14 d時降至正常范圍。受試者工作特征曲線（ROC）分析表明，當(dāng)6 h時ANRIL表達值為正常對照的3.65倍（最高值）時，其敏感性為91.9%，特異性為91.1%，為最佳診斷節(jié)點;而cTnT值上升至24 h（最高值）時，診斷AMI的敏感性為91.8%，特異性可高達92.4%。 結(jié)論 AMI患者循環(huán)血ANRIL的表達明顯升高，并隨著病程而動態(tài)改變，與cTnT比較具有更早的時間窗和達峰時間，具備早期診斷AMI的可行性，但敏感性和特異性并不明顯優(yōu)于cTnT。

[關(guān)鍵詞] ANRIL;急性心肌梗死;肌鈣蛋白T;生物學(xué)標(biāo)志物

[中圖分類號] R542.2+2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0080-04

[Abstract] Objective To investigate the value of circulating ANRIL in the early diagnosis of acute myocardial infarction （AMI）. Methods Blood samples were collected from 50 AMI patients （experimental group） and 30 patients with coronary angiography normally （control group） from November 2016 to June 2018 in Affiliated Ethnic Hospital of Guangxi Medical University （hereinafter referred to as “our hospital”）. Quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect the levels of circulating ANRIL at different time intervals （0-6 h， 12 h， 24 h， 7 d and 14 d） after the onset of symptoms of AMI. And the level of plasma cTnT was detected by using electrochemiluminescence. Results There was no significant difference in age， gender， smoking， diabetes， LDL-C， SBP， DBP and Cr between two groups （P > 0.05）. There was significant difference in cTnT between two groups （P < 0.05）. Compared with control group， the expression level of ANRIL and cTnT in the plasma of AMI patients increased significantly （P < 0.05）. In experimental group， the expression level of ANRIL began to increase at the time of admission， decreased after reaching the peak at 12 h， and decreased to the normal range at 7 d. CTnT had a very long diagnostic window period， it started to rise significantly at 6-12 h， then decreased at 24 h， and falled to the normal range at 14 d. ROC analysis showed that when the expression value of ANRIL in 6 h was 3.65 times （the highest value） of the normal control， the sensitivity was 91.9%， the specificity was 91.1%， which was the best diagnostic node; when the cTnT value increased to the highest value of 24 h， the sensitivity and specificity of AMI diagnosis was 91.8%， 92.4% respectively. Conclusion The expression of circulating ANRIL in AMI patients increases significantly and changes dynamically with the course of disease. Compared with cTnT， circulating ANRIL has earlier time window and peak time. It has good early sensitivity and specificity for the diagnosis of AMI.

[Key words] ANRIL; Acute myocardial infarction; Troponin T; Biological markers

急性心肌梗死（AMI）是發(fā)病率和死亡率非常高的一類心血管疾病[1-4]，盡早進行再灌注治療可顯著降低其病死率[5]。但作為早期診斷AMI的常用“金標(biāo)準(zhǔn)”——肌鈣蛋白[6]，在終末期腎病等疾病中也明顯升高[7]，特異性不足。因此，有必要尋找對迅速診斷AMI具有更高特異性和敏感性的生物學(xué)指標(biāo)。lncRNA是一類長度> 200個核苷酸、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本。已有研究表明，Chr9p21.3位點的lncRNA ANRIL與冠狀動脈粥樣硬化密切相關(guān)[8-10]。本研究通過檢測AMI患者循環(huán)血ANRIL和肌鈣蛋白T（cTnT）的表達，分析ANRIL早期診斷AMI的可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2016年11月～2018年6月收治的50例AMI患者作為實驗組，其中男32例，女18例，平均年齡（63.2±7.1）歲。所有患者均于癥狀發(fā)作后0～6 h[（2.2±0.6）h]內(nèi)入院，且均經(jīng)冠狀動脈造影（CAG）確診，AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)指南[11]，排除合并有心力衰竭、腎功能不全等其他繼發(fā)性因素。隨機選取30例CAG正常者作為對照組，其中男18例，女12例，平均年齡（61.4±7.2）歲。研究過程獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得受試者同意。對所有受試者制訂統(tǒng)一表格，記錄性別、年齡、血壓、血脂和心電圖等一般資料。

1.2 血漿的采集保存和總RNA抽提

實驗組靜脈血標(biāo)本（5 mL）分別在AMI癥狀出現(xiàn)的不同時間段（0～6 h、12 h、24 h、7 d、14 d）采集;另外對照組30例血標(biāo)本未區(qū)分時間段。TRIzol LS@試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）進行血漿總RNA抽提。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

按操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，測定ANRIL表達水平（杭州，安杰思AGS4800）。

1.4 電化學(xué)發(fā)光法檢測受試者血漿cTnT水平

具體過程參照電化學(xué)發(fā)光法試劑盒（Roche Diagnostics，Switzerland）說明書（羅氏公司COBAS E602全自動生免電化學(xué)發(fā)光儀），cTnT<99.9 ng/L定義為正常值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。受試者工作特征曲線（ROC）和曲線下面積（AUC）用于分析兩組間的差異。AUC=1.0為最理想檢測指標(biāo)，AUC<0.5為無診斷價值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者基本臨床特征和實驗室指標(biāo)比較

兩組年齡、性別、吸煙、糖尿病、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、收縮壓、舒張壓、血肌酐（Cr）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。實驗組cTnT水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 循環(huán)血ANRIL和cTnT表達水平與AMI的關(guān)系

與對照組比較，實驗組血漿中循環(huán)ANRIL和cTnT表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。實驗組循環(huán)血ANRIL表達水平在入院時即開始升高，在12 h達峰值之后有所下降，7 d時已降至正常范圍;cTnT具有相當(dāng)長的診斷窗口期，在6～12 h開始顯著上升，24 h達峰值后有所下降，14 d時降至正常范圍。見圖1。

2.3 循環(huán)ANRIL早期診斷AMI的可行性

當(dāng)AMI癥狀發(fā)作6 h時ANRIL表達值為正常對照的3.65倍（最高值）時，其敏感性為91.9%，特異性為91.1%，為最佳診斷節(jié)點;而cTnT值上升至24 h（最高值）時，診斷AMI的敏感性為91.8%，特異性可高達92.4%。見表2。

3 討論

在AMI臨床診療過程中，有1/3以上患者缺乏典型癥狀，過去十余年的臨床實踐顯示肌鈣蛋白是臨床診斷AMI最重要的標(biāo)志物，但其劣勢也逐步顯現(xiàn)[12]：①診斷特異性不高，很多非AMI疾病如心肌炎心肌病、腎功能不全（尿毒癥）、肺栓塞等也會出現(xiàn)cTnT的升高。②早期診斷敏感性不足：cTnT僅存于正常人的心臟中，在不可逆心肌缺血癥狀發(fā)作3～6 h后才能在外周血中被檢測出來。不利于超急性期診斷，甚至有可能導(dǎo)致漏診錯診，尤其是對于發(fā)病時間<1 h就診的患者，只能動態(tài)觀察病情改變。

lncRNA是一類位于胞核或胞漿內(nèi)、長度>200 nt的功能性RNA分子，在核內(nèi)物質(zhì)運輸、基因轉(zhuǎn)錄、激活以及干擾等病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用;其結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，存在明顯組織特異性，在一些疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的lncRNA表達譜和表達水平顯著變化，在體液中比如血液和尿液可以直接檢測，已一躍成為目前基因領(lǐng)域研究的新熱點[13]。近來，lncRNA還被證明與心力衰竭、主動脈夾層、心肌病等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。ANRIL是人染色體9p21上的一個重要lncRNA。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL所處的9p21基因染色體是一個非常重要的冠心病易感區(qū)域，影響冠狀動脈平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[17]、單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和動脈粥樣斑塊形成，與脂代謝密切相關(guān)[18];反之，與冠心病相關(guān)的風(fēng)險等位基因亦能影響ANRIL的表達，已相繼在不同的研究人群中得到印證[15，19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①實驗組循環(huán)血ANRIL水平明顯高于對照組，0～6 h已出現(xiàn)明顯升高，7 d時回落至正常水平，時間窗明顯早于cTnT，數(shù)據(jù)揭示ANRIL表達水平的變化與AMI進程相一致。與之相近的是，Zhang[20]采用qRT-PCR法檢測腹腔注射鏈脲佐菌素結(jié)扎左前降支造成2型糖尿病并發(fā)心肌梗死（T2DM-MI）小鼠模型外周血ANRIL水平，結(jié)果提示，在T2DM-MI患者外周靜脈血和T2DM-MI模型小鼠心肌組織中，ANRIL表達上調(diào);反之，過表達ANRIL可導(dǎo)致T2DM-MI小鼠心功能不全，增加心體重指數(shù)和梗死面積，導(dǎo)致模型小鼠心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，增加心肌纖維化相關(guān)蛋白TGF-β1、collagenⅠ和collagenⅢ的表達;然而，敲除ANRIL基因產(chǎn)生了相反的效果。②ANRIL表達水平與患者年齡、性別、吸煙、血脂水平等無明顯關(guān)系，而與心肌壞死程度和病程發(fā)展密切相關(guān)，從病理生理機制上看，肌鈣蛋白主要結(jié)合在肌原纖維上，僅不到5%儲存在胞漿中，ANRIL蛋白復(fù)合物主要存在于胞漿。在AMI初始階段，ANRIL或許可從壞死心肌細(xì)胞的胞漿中釋放進入外周血循環(huán)。結(jié)合上述兩點，提示ANRIL高表達可能在心肌梗死早期診斷和病情發(fā)展中發(fā)揮作用，具備作為早期診斷AMI生物標(biāo)志物的可能性。③與此同時，ROC分析結(jié)果提示，在迅速診斷AMI方面ANRIL具有明確的心肌敏感性和特異性，其表達變化與AMI病程有著良好的一致性，但ROC分析并未發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性明顯優(yōu)于cTnT。我們進一步推測，或許ANRIL與cTnT聯(lián)合早期診斷AMI具有更大的優(yōu)勢，可提高敏感性和特異性，防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)ANRIL在AMI患者循環(huán)血中的表達特點，對AMI早期診斷有一定參考價值，但尚存在樣本量偏少、研究方法較復(fù)雜而單一等局限性。例如Vausort等[16]用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測414例PCI治療的AMI患者外周血細(xì)胞中5種lncRNA表達水平，結(jié)果提示，AMI患者外周血ANRIL水平較對照組明顯降低。研究結(jié)果得出與本研究相反結(jié)論的原因有待進一步探討。此外，AMI患者的基礎(chǔ)病如糖尿病、高血壓等是否會對血漿ANRIL水平產(chǎn)生影響尚不清楚，需進一步深入研究。

[參考文獻]

[1]? White HD，Chew DP. Acute myocardial infarction [J]. Lancet，2008，372（9638）：570-584.

[2]? Adler C，Baldus S. Troponin elevation—does every patient require coronary angiography？ [J]. Med Klin Intensivmed Notfmed，2019.[Epub ahead of print]

[3]? 張駿，田華偉.阿司匹林聯(lián)合替格瑞洛對急性心肌梗死患者不良心臟事件的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018，56（24）：40-43.

[4]? 姚鍇，余桂霞，曾仙梅.急性心肌梗死患者住院期間近期轉(zhuǎn)歸的影響因素分析[J].河北醫(yī)學(xué)，2019，25（7）：1217-1221.

[5]? Antman EM，Hand M，Armstrong PW，et al. 2007 Focused Update of the ACC/AHA 2004 Guidelines for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction：a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines：developed in collaboration with the Canadian Cardiovascular Society endorsed by the American Academy of Family Physicians：2007 Writing Group to Review New Evidence and Update the ACC/AHA 2004 Guidelines for the Management of Patients with ST-Elevation Myocardial Infarction，Writing on Behalf of the 2004 Writing Committee [J]. Circulation，2008，117（2）：296-329.

[6]? 陳峰，龐繼恩，孫強，等.急性心肌梗死患者血清高敏肌鈣蛋白T及線粒體偶聯(lián)因子-6含量的變化[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2012，4（5）：431-433.

[7]? van Rooij E，Liu N，Olson EN. MicroRNAs flex their muscles [J]. Trends Genet，2008，24（4）：159-166.

[8]? Harismendy O，Notani D，Song X，et al. 9p21 DNA variants associated with coronary artery disease impair interferon-gamma signalling response [J]. Nature，2011，470（7333）：264-268.

[9]? Folkersen L，Kyriakou T，Goel A，et al. Relationship between CAD risk genotype in the chromosome 9p21 locus and gene expression. Identification of eight new ANRIL splice variants [J]. PLoS One，2009，4（11）：e7677.

[10]? Broadbent HM，Peden JF，Lorkowski S，et al. Susceptibility to coronary artery disease and diabetes is encoded by distinct，tightly linked SNPs in the ANRIL locus on chromosome 9p [J]. Hum Mol Genet，2008，17（6）：806-814.

[11]? Thygesen K，Alpert JS，Jaffe AS，et al. Third universal definition of myocardial infarction [J]. Glob Heart，2012， 7（4）：275-295.

[12]? Agewall S，Giannitsis E，Jernberg T，et al. Troponin elevation in coronary vs. non-coronary disease [J]. Eur Heart J，2011，32（4）：404-411.

[13]? Cao WJ，Wu HL，He BS，et al. Analysis of long non-coding RNA expression profiles in gastric cancer [J]. World J Gastroenterol，2013，19（23）：3658-3664.

[14]? Wang S，Zhang X，Yuan Y，et al. BRG1 expression is increased in thoracic aortic aneurysms and regulates proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells through the long non-coding RNA HIF1A-AS1 in vitro [J]. Eur J Cardiothorac Surg，2015，47（3）：439-446.

[15]? Kumarswamy R，Bauters C，Volkmann I，et al. Circulating long noncoding RNA，LIPCAR，predicts survival in patients with heart failure [J]. Circ Res，2014，114（10）：1569-1575.

[16]? Vausort M，Wagner DR，Devaux Y. Long noncoding RNAs in patients with acute myocardial infarction [J]. Circ Res，2014，115（7）：668-677.

[17]? Hung J，Miscianinov V，Sluimer JC，et al. Targeting non-coding RNA in vascular biology and disease [J]. Front Physiol，2018，9（22）：1655.

[18]? Kumar S，Williams D，Sur S，et al. Role of flow-sensitive microRNAs and long noncoding RNAs in vascular dysfunction and atherosclerosis [J]. Vascul Pharmacol，2019， 114：76-92.

[19]? Johnson AD，Hwang SJ，Voorman A，et al. Resequencing and clinical associations of the 9p21.3 region：a comprehensive investigation in the Framingham heart study [J]. Circulation，2013，127（7）：799-810.

[20]? Zhang L，Wang YM. Expression and function of lncRNA ANRIL in a mouse model of acute myocardial infarction combined with type 2 diabetes mellitus [J]. J Chin Med Assoc，2019，9（82）：685-692.

（收稿日期：2019-08-28? 本文編輯：李亞聰）