乳酸菌代謝物中二肽基肽酶-4抑制劑的分離純化及鑒定

董 杰，劉 鷺，甲承立，朱俊玲,，呂加平,

（1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030800；2.北京市營養(yǎng)源研究所系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術研究中心，北京 100069；3.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100193）

糖尿病是一種由多種原因引起的代謝紊亂性疾病，主要是由于體內的胰島素分泌不足或胰島素抵抗導致血糖過高或過低，其顯著特點是長期高血糖[1]。長期高血糖容易造成大血管、微血管的損害，進而使腦、腎、心、眼、神經等多個器官受損，最終可能導致患者失明，引起尿毒癥、腦中風、心肌梗塞等并發(fā)癥，甚至危及生命[2]。2017年底，國際糖尿病聯(lián)盟公布了第八版全球糖尿病地圖，結果顯示，全球糖尿病患者從2000年的1.51億到2017年的4.25億，增加了近2 倍，平均每11 個人中就有1 位患病者。其中，中國患病人數達1.14億，是全球糖尿病患病人數最多的國家[3]。

現(xiàn)已有幾類降糖藥可用于治療糖尿病，包括磺酰脲類、甲格列奈類、噻唑烷二酮類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。但它們具有共同的副作用，即體重增加和低血糖，這使得長期治療無法控制最佳血糖[4]。因此，為改善治療效果，降低副作用，出現(xiàn)了治療II型糖尿病的新方法。其中，二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑是目前比較新穎且有前途的抗糖尿病藥物。

DPP-4又稱T細胞表面抗原CD26，是廣泛存在于細胞膜上的一類具有潛在的調節(jié)免疫、內分泌以及神經系統(tǒng)等功能的膜結合絲氨酸蛋白酶，其存在于多種器官中且家族成員眾多[5]，在腸道中高表達，于肝臟、胰腺、胎盤、胸腺等處也有表達，部分以可溶形式存在于循環(huán)血液中[6]。凡是N端第2位存在脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽均是該類酶的底物，其可以從肽鏈的N端將這兩個氨基酸殘基水解使該活性多肽失活[7]。如胃腸道激素、神經肽、細胞因子等都是DPP的底物，但在人體中DPP-4的底物只有葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[8-9]。生成GLP-1的腸道L細胞主要位于回腸下段，所有存貯在L細胞微粒中的GLP-1都是有活性的，但DPP-4使GLP-1快速失活且不可逆，因而GLP-1在體內的半衰期極短，其中大約75%的GLP-1離開腸道前已經被降解為無活性的代謝產物，此后40%～50%的門靜脈血GLP-1在肝臟中降解，因此，僅10%～15%有活性的GLP-1能到達體循環(huán)[10-11]。DPP-4抑制劑競爭性結合GLP-1和GIP中與DPP-4作用部分，從而延緩GLP-1和GIP在體內的降解，增強其促胰島素分泌和葡萄糖調節(jié)活性。此外，在某些情況下，抑制DPP-4同時可以降低糖尿病患者的心血管危險因素，降低血壓，改善餐后高血糖，減少炎癥標志物、氧化應激、血小板聚集以及改善內皮功能等[12]。目前市場上DPP-4抑制劑類藥物多為列汀類，但是據一些藥物上市后的檢測結果顯示，西格列汀可引起嚴重的過敏反應以及出血性或壞死性急性胰腺炎；維格列汀有肝毒性報道。因此，列汀類DPP-4抑制劑的長期安全性仍然需要更多的臨床研究來評價[13]。尋找天然來源的DPP-4抑制劑被提上日程。

乳酸菌作為定居腸道中的有益菌群具有多種生理功能，如緩解乳糖不耐受癥、改善便秘和腹瀉、維持腸道微生態(tài)平衡和腸管機能、增強免疫功能和抗腫瘤、影響心血管疾病的發(fā)展、緩解過敏反應等[14-15]。近年來，一些研究報道乳酸菌還具有抑制DPP-4和α-葡萄糖苷酶的作用，因而已經成為控制糖尿病、緩解高血糖和增加胰島素敏感性的潛在新型和天然治療藥物。本研究的目的是篩選出1 株對DPP-4有良好抑制作用的乳酸菌，并用多種方法對乳酸菌的代謝物進行分離純化，最終鑒定出乳酸菌代謝物中抑制DPP-4的主要物質，為以后實施代謝調控提供理論基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株均由中國農業(yè)科學院農產品加工研究所乳品實驗室保藏。

重組人源DPP-4（D4943）、N-甘氨酰脯氨酰-對硝基苯胺鹽酸鹽（N-glycyl-prolyl-p-nitroanilide hydrochloride，Gly-Pro-pNA，0513-100MG） 美國Sigma公司；抑二肽素A 英國Abcam公司；西格列汀杭州默沙東制藥有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 北京廣達恒益科技有限公司；甲醛、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Spark 20M全波長酶標儀 瑞士TECAN公司；3K15離心機 美國Sigma公司；MB-102高通量組織恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；蛋白分離純化系統(tǒng) 美國GE公司；半制備液相色譜儀 美國安捷倫公司；超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質譜系統(tǒng)美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將實驗室保藏的植物乳桿菌BLP12和1.6970分別接入無菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h，活化3 代后用于后續(xù)實驗。

將活化好的菌株以4%（V/V）接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行菌株菌落總數的測定，將菌液濃度調節(jié)為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 無細胞發(fā)酵上清液（cell-free excretory supernatant，CFS）的制備[16]

將保藏的益生菌菌種活化3 代后，按4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉培養(yǎng)基收集菌體。將收集到的菌體用無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，渦旋混勻。接著于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，以同樣的條件離心15 min，收集上清液，用0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFS，-80 ℃保存以備使用。

1.3.2.2 無細胞胞內提取物（cell-free intracellular extract，CFE）的制備[17]

將所用的益生菌菌種活化3 代后，按4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉培養(yǎng)基收集菌體。將收集到的菌體用無菌0.1 mol/L PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，渦旋混勻，用超聲波細胞破碎儀破碎細胞。超聲破碎的條件為：在冰浴的條件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎12 min。將超聲后得到的液體于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFE，-80 ℃保存以備使用。

1.3.2.3 豬小腸中DPP-4的制備[18]

將新鮮豬小腸的內容物雜質清理干凈，用冷藏過的pH 6.8的PBS沖洗。在冰浴環(huán)境下切開，用干凈的載玻片分別刮取十二指腸、空腸、回腸黏膜及其表面黏液。將刮取下的黏膜及黏液加入等體積的pH 6.8 PBS，低溫下勻漿，然后將混合物在 4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清液，凍存于-20 ℃以備用。 將豬小腸黏膜液的上清液用pH 6.8 PBS稀釋90 倍，作為DPP-4使用。

1.3.3 DPP-4抑制率的測定

底物Gly-Pro-pNA在DPP-4的作用下發(fā)生降解，生成的對硝基苯胺在405 nm波長下具有強烈光吸收，因此可依據單位時間內吸光度的改變程度表示酶促反應速率[19]。

取96 孔板，用微量移液器在反應孔中加入25 μL 1.6 mmol/L的底物Gly，接著加入25 μL待測樣品（對照加入0.1 mol/L PBS（pH 8），37 ℃反應10 min，加入DPP-4（豬小腸）50 μL，金屬浴37 ℃反應1 h，加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3終止反應，用酶標儀在405 nm波長處測樣品的吸光度，每組3 個平行。抑制率的計算公式如下[20]：

式中：A為Gly＋樣品＋酶＋Na2CO3；B為Gly＋樣品＋PBS＋Na2CO3；C為Gly＋PBS＋酶＋Na2CO3；D為Gly＋PBS＋PBS＋Na2CO3。

1.3.4 樣品的分離純化

1.3.4.1 超濾

取適量樣品加入到50 mL的超濾管中，依次用10、5、3 kDa的超濾管進行逐步分離，按不同的分子質量范圍對樣品進行收集：＜3 kDa，3～5 kDa，5～10 kDa，＞10 kDa。測定各個部分的DPP-4抑制活性。選擇活性強的一部分進行下一步分離純化。

1.3.4.2 有機溶劑提取

取100 mL發(fā)酵上清液置于分液漏斗，分別用甲醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯有機溶劑進行萃取。萃取體積按照1∶1進行，萃取后分別收集水相部分和有機相部分，對收集到的樣品用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，接著用5 mL超純水反復洗脫壁上的殘留物質，將收集到的洗脫液進行活性測定[21]。

1.3.4.3 凝膠色譜柱分離

選擇抑制活性強的部分進一步用AKTA蛋白分離純化系統(tǒng)按不同分子質量對樣品進行分離，流動相使用0.5 mmol/L的PBS，收集出峰，并對每個收集到的峰進行活性檢測。使用Superdex peptide柱進行分離，分離分子質量范圍0.1～7 kDa，進樣量1 mL，流速2 mL/min，檢測波長214 nm。

1.3.4.4 半制備高效液相色譜進一步純化

選出活性較高的部分，用半制備高效液相色譜進一步分離純化活性物質，檢測使用Innoval C18柱（21.2 mm×250 mm），進樣量1.5 mL，流速5 mL/min，檢測波長為214 nm，流動相A為超純水溶液，流動相B為乙腈溶液，梯度條件如表1所示。收集每一個出峰部分，對收集到的峰物質進行活性檢測。

表 1 半制備高效液相色譜流動相洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient elution program of semi-preparative high performance liquid chromatography

1.3.5 超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質譜分析

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；載氣（He）流速：0.40 mL/min，進樣量20 μL，柱溫45 ℃；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為乙腈（含0.1%甲酸）。

1.3.5.2 質譜條件

電噴霧離子源，正負離子掃描模式，進樣電壓和碰撞電壓分別為10 000、40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為120 ℃和500 ℃，載氣流量900 L/h，質譜掃描范圍m/z50～1 000，掃描時間和間隔時間分別為：0.1 s和0.02 s。

1.4 數據分析

數據預處理在進行模式識別之前，原始數據經代謝組學處理軟件QI（Waters，Milford，USA）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣，并與Metlin、HMDB、本地庫等譜庫進行對比，對物質進行定性。

所有數據用 ±s的形式表示，采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，Excel進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 CFS和CFE對DPP-4的抑制力

表 2 益生菌對DPP-4的抑制率Table 2 DPP-4 inhibitory rates of probiotics

由表2可以看出，陽性對照組對DPP-4的抑制率最高，為32.33%；除菌株1.6970外，其余菌株的CFE均對DPP-4有較弱的抑制作用，抑制活性最強的為菌株1.1881，但抑制活性僅為9.5%左右。6 株菌株的CFS對DPP-4均具有抑制活性，而且除菌株1.6970外其余菌株的CFS抑制率都比其CFE的抑制率高；其中植物乳桿菌BLP12的抑制率最高，抑制率為27%左右，其次是ST-2；對于菌株1.6970不論是CFS還是CFE其抑制率都是最低的，所以選擇其作為抑制活性最高菌株BLP12的對照菌株。Panwar等[12]從嬰兒糞便中分離出15 株乳酸菌，并對比了乳酸菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對DPP-4的抑制率，研究結果發(fā)現(xiàn)從嬰兒糞便中分離的乳酸菌對DPP-4的抑制力最高，抑制率達25%，而對照菌株對DPP-4的抑制率均很弱，有些甚至有促進作用。本實驗所選菌株的CFS中具有良好的DPP-4抑制能力；而CFE中不含或含有極少的該類抑制物，所以選取BLP12的CFS做下一步的研究。

2.2 不同萃取溶劑CFS萃取物對DPP-4抑制活性的影響

圖 1 不同有機溶劑CFS萃取物對DPP-4的抑制率Fig. 1 DPP-4 inhibition rates of extracts obtained with different organic solvents

經有機溶劑萃取后，甲醇和丙酮與水互溶形成的萃取液不分層，石油醚和乙酸乙酯與水不溶或部分溶解，所以形成的萃取液分為上下兩層，上層為有機相部分，下層為水相部分。從圖1可以看出，對于植物乳桿菌1.6970，本實驗所選用的有機溶劑的萃取液對DPP-4均有抑制活性，其中甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取液水相部分對DPP-4的抑制活性較高，而且均高于原液；石油醚萃取液水相部分和有機相部分、乙酸乙酯萃取液有機相部分的抑制活性低于原液，石油醚萃取液水相部分對DPP-4的抑制活性最弱，抑制率僅有3%左右；對于植物乳桿菌BLP12，除石油醚外其他有機溶劑的萃取液對DPP-4均有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取液水相部分對DPP-4的抑制活性最高，顯著高于原液，抑制率高達50%左右；其次是丙酮萃取液，抑制率為27%左右；甲醇、乙酸乙酯萃取液有機相部分的抑制活性均低于原液；石油醚萃取液對DPP-4沒有抑制作用，反而有促進作用。

通過圖1可以看出，植物乳桿菌BLP12的乙酸乙酯萃取液水相部分對DPP-4的抑制活性最高，所以最終選擇乙酸乙酯作為萃取劑。

2.3 CFS萃取液的分級分離及其分離組分的DPP-4抑制活性

圖 2 CFS萃取液不同分子質量組分對DPP-4的抑制率Fig. 2 DPP-4 Inhibition rates of fractions with different molecular masses

如圖2所示，樣品經過不同分子質量的分級后，所得部分的抑制率均有所下降。植物乳桿菌1.6970不同分子質量大小的CFS對DPP-4均具有抑制活性，其中分子質量小于5 kDa的樣品抑制活性最強，分子質量大于10 kDa和5～10 kDa的樣品的抑制活性較弱，因此推測具有DPP-4抑制作用的物質分子質量小于5 kDa。植物乳桿菌BLP12不同分子質量大小的CFS對DPP-4均具有抑制活性，而且均比1.6970的抑制活性高；分子質量小于5 kDa的CFS的抑制活性遠大于分子質量5～10 kDa，因此，推測植物乳桿菌BLP12的CFS中抑制DPP-4的活性物質主要為小于5 kDa的物質。這與Huang等[22]研究結果一致，其發(fā)現(xiàn)在豬皮明膠的水解產物中分子質量在1～1.25 kDa之間的物質對DPP-4的抑制率最高，達35%。分析降糖物質可能大多數為小分子物質。

圖 3 植物乳桿菌1.6970（a）和BLP12（b）凝膠色譜柱分離圖Fig. 3 Chromatographic separation profiles of metabolites of Lactobacillus plantarum 1.6970 (a) and BLP12 (b) on Superdex peptide column

將超濾后分子質量小于5 kDa的溶液進行收集，并利用Superdex peptide層析柱對樣品進行進一步分離純化。從圖3可以看出，植物乳桿菌1.6970分出9 個組分，BLP12分出10 個組分，對每個組分進行收集，并標記1.6970的9 個組分為A-1～A-9，BLP12的10 個組分為B-1～B-10。測定各個組分的DPP-4抑制活性。

圖 4 柱層析各個組分對DPP-4的抑制率Fig. 4 DPP-4 inhibition rates of fractions separated by column chromatography

如圖4所示，植物乳桿菌1.6970的所有組分對DPP-4均具有抑制活性，但抑制活性都較弱，其中抑制活性較高的有A-4，經過2 次柱子的稀釋后仍具有14%抑制率。對于BLP12菌株，收集到的10 個組分均具有抑制活性，且每個組分的抑制活性都較高，其中組分B-5的抑制活性最高，抑制率高達46%，比原液的抑制率高19%；其次是組分B-9，抑制率為37%。所以最終選擇植物乳桿菌BLP12的組分B-5和組分B-9進行下一步的分離純化。

圖 5 B-9（a）和B-5（b）半制備液相色譜分離圖Fig. 5 Semi-preparative liquid chromatograms of B-9 (a) and B-5 (b)

將樣品B-5和B-9用半制備高效液相色譜進行進一步分分離純化，如圖5所示，B-5分離出4 個組分，分別記為B-5-1、B-5-2、B-5-3、B-5-4；B-9分離出2 個組分，分別記為B-9-1和B-9-2。對分離得到各個組分進行收集并測定對DPP-4的抑制率，以便選擇最終進行質譜鑒定的樣品。

圖 6 半制備液相各組分對DPP-4的抑制率Fig. 6 DPP-4 inhibition rate of subfractions separated from B-9 and B-5

從圖6可以看出，組分B-9-1的抑制活性很低，組分B-9-2沒有抑制活性；B-5經分離得到的4 個組分除B-5-4外，其余組分都有較弱的抑制活性，B-5-3的抑制活性最高，抑制率為8%左右。盡管組分B-5-3的抑制活性最高，但是由于樣品經過多次分離純化，已經被稀釋很多倍，樣品中可以抑制DPP-4的活性物質含量已十分稀少，所以在進行下一步的質譜鑒定前，將樣品用冷凍濃縮機進行濃縮。

2.4 質譜鑒定結果

表 3 質譜鑒定的物質Table 3 Metabolites of strain BLP12 identified by LC-MS-MS

植物乳桿菌BLP12的細胞代謝物經分離純化后用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀鑒定代謝物中的物質種類，共鑒定出61 種物質，表3為鑒定出的物質名稱以及相對分子質量。

3 討論與結論

本研究測定6 株益生菌的細胞代謝物和細胞內容物的DPP-4抑制作用，結果顯示植物乳桿菌BLP12的細胞代謝物對DPP-4的抑制效果最為顯著，將BLP12的代謝物進行分離純化并用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測樣品中物質種類，最終得到61 種物質，經查證其中11 種物質與治療糖尿病相關，其中有4 種DPP-4抑制劑，其余7 種與治療糖尿病相關物質。這11 種物質分別是十二烷基硫酸鹽、煙酸、環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、亮氨酸脯氨酸、十二烷二酸、吡啶羧酸、十八碳三烯酸、別嘌呤醇、鳥嘌呤、鄰苯三酚、曲酸。

早在2006年，Ellison等[23]發(fā)現(xiàn)(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫[l,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-l-(2,4,5-三氟苯基)丁胺的十二烷基硫酸鹽是DPP-4的有效抑制劑，可用于治療II型糖尿??；Miyamoto等[24]在煙酸的衍生物中發(fā)現(xiàn)了DPP-4抑制劑；Garg等[25]在1990年就發(fā)現(xiàn)煙酸可以治療二型糖尿病的血脂異常；同時煙酸類藥物還可以通過升高高密度脂蛋白、降低血漿甘油三酯和低密度脂蛋白等作用來調節(jié)糖尿病人的血脂異常情況[26]；有研究表明，具有xaa-pro序列（xaa代表氨基酸）的二肽可以作為DPP-4抑制劑；所以環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)和亮氨酸脯氨酸是可能的DPP-4抑制劑。

十二烷二酸可以降低機體對葡萄糖攝取和氧化，改善糖尿病患者的代謝不靈活。Mingrone等[27]發(fā)現(xiàn)十二烷二酸可以通過底物競爭機制降低胰島素誘導的葡萄糖攝取和氧化，從而節(jié)省葡萄糖利用和增加糖原貯存；同時Salinari等[28]發(fā)現(xiàn)十二烷二酸在促進脂肪氧化的同時不刺激胰島素分泌，這意味著對于II型糖尿病患者，可以減少胰島素誘導的葡萄糖攝取和氧化，從而節(jié)省葡萄糖的利用和增加糖原的貯存。吡啶羧酸與麥芽酚、L-蘇氨酸的復合物具有降血糖的作用。Kojima[29]每日向小鼠腹腔注射麥芽酚、L-蘇氨酸和吡啶酸鋅（II）復合物，14 d后測定其口服葡萄糖耐量和HbA1c水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病情況有所改善。十八碳三烯酸可以激活脂肪細胞過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）γ[30]。已知過氧化物酶體增殖劑激活受體活化劑具有有效的抗高血糖活性，用于治療糖尿病相關的胰島素抵抗。因此，許多天然和合成的PPARγ激動劑被用于治療葡萄糖疾病。別嘌呤醇具有降低II型糖尿病患者蛋白尿的作用，Momeni等[31]通過向實驗者給予別嘌呤醇（100 mg/d），發(fā)現(xiàn)在接受藥物治療4 個月后，受試者的血清尿酸水平尿蛋白水平顯著降低，因此，別嘌呤醇可作為糖尿病腎病患者經濟有效的輔助治療。鄰苯三酚可以抑制α-葡萄糖苷酶，Zheng Li等[32]通過動力學模擬實驗發(fā)現(xiàn)鄰苯三酚可以競爭性的與α-葡萄糖苷酶的活性位點相連接來抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

從植物乳桿菌BLP12的代謝物中分離出的這些物質充分說明，植物乳桿菌不僅具有抑制DPP-4的作用，還可以通過其他多種方式改善糖尿病的癥狀。