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    蝦蛄可食組織中鎘和砷的形態(tài)及分布特征

    2020-04-25 05:38:22趙艷芳康緒明寧勁松翟毓秀尚德榮丁海燕盛曉風(fēng)
    食品科學(xué) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:蝦蛄中鎘肌肉組織

    趙艷芳,康緒明,寧勁松,翟毓秀,尚德榮,*,丁海燕,盛曉風(fēng)

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

    蝦蛄(Oratosquilla oratoria),俗名琵琶蝦、皮皮蝦,隸屬甲殼綱、口足目、蝦蛄科,主要生活在近海淺灘、泥質(zhì)海底的巢穴之中,全國(guó)各地沿海均有分布,也是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。隨著海洋捕撈魚(yú)類資源的嚴(yán)重衰退,蝦蛄已成為一些海域漁獲量最高的種類之一[1-3]。蝦蛄風(fēng)味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì)、磷、微量元素以及人體必需的氨基酸。蝦蛄提取物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用,可作為一類新型、天然的抗腫瘤藥物[4-7]。近年來(lái)隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,蝦蛄已成為深受人們喜愛(ài)的佳肴。

    沿海水域重金屬污染直接影響水產(chǎn)品中重金屬的含量。鎘是一種生物體非必需的有毒重金屬,被美國(guó)毒物管理委員會(huì)列為第6位危害人體健康的有毒物質(zhì)。對(duì)國(guó)內(nèi)外沿海水域經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品的重金屬污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)貝類、甲殼類中重金屬的含量遠(yuǎn)高于魚(yú)類[8-10]。對(duì)蝦蛄的質(zhì)量安全研究發(fā)現(xiàn),蝦蛄可食組織中鎘的含量較高,超標(biāo)非常嚴(yán)重[11-12]。鎘等有害元素成為影響蝦蛄食用安全的關(guān)鍵因素,近幾年,諸多有關(guān)蝦蛄“鎘污染”的新聞、媒體負(fù)面報(bào)道也給消費(fèi)者與生產(chǎn)者帶來(lái)不良的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)影響。砷是一種有毒有害的非金屬元素,廣泛存在于自然界中。海產(chǎn)品中含有大量不同形態(tài)的砷[13-14],人們?cè)谑秤煤榈暮.a(chǎn)品時(shí),砷在人體內(nèi)易發(fā)生富集對(duì)人體的生命健康造成一定威脅。世界衛(wèi)生組織和美國(guó)環(huán)保局將砷定級(jí)為“已知的人類致癌物質(zhì)”[15]。由于水生生物對(duì)鎘、砷等有害元素的強(qiáng)富集性,使得原本提供豐富優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的水產(chǎn)品成為有毒有害元素進(jìn)入人體的橋梁。

    鎘、砷的毒性與它的化學(xué)形態(tài)有關(guān),因此,對(duì)蝦蛄中鎘、砷的檢測(cè)與食用安全評(píng)估不能僅以有害元素的總量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。蝦蛄可食組織主要包括性腺和肌肉,尤其是性成熟時(shí)期的蝦蛄產(chǎn)品更受消費(fèi)者青睞,但截至目前針對(duì)可食組織中鎘、砷的分布特征及其形態(tài)研究較少,因此,本研究擬運(yùn)用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICPMS)技術(shù)以及高效液相色譜-ICP-MS(high performance liquid chromatography-ICP-MS,HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定蝦蛄可食組織中鎘、砷的分布特征及其形態(tài),以期為蝦蛄中鎘、砷的食用安全評(píng)估提供一定科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    性成熟的海捕野生蝦蛄于2018年5月隨機(jī)采集于山東青島沿海主要碼頭(2 份雄性,3 份雌性)和遼寧大連水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)(4 份雄性,2 份雌性),每份樣品約1 000 g。

    草酸、無(wú)水氫氧化鋰、無(wú)水乙酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉(均為優(yōu)級(jí)純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硝酸(優(yōu)級(jí)純) 上海泰坦科技股份有限公司。

    砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液(As(III),GBW 08666)、亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液(As(V),GBW 08667)、砷甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(AsB,GBW 08670)、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(monomethylarsonic acid,MMA,GBW 08668)、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(dimethylarsinic acid,DMA,GBW 08669)、無(wú)機(jī)鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(Cd2+,GBW 08612)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Elan DRC II ICP-MS儀、HPLC-ICP-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Perkin Elmer公司;Mars 6密閉微波消解儀 美國(guó)CEM公司;MS3旋渦混勻儀 德國(guó)IKA公司;Neofuge 15臺(tái)式高速離心機(jī) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品制備

    蝦蛄樣品去殼和頭后,取出可食用組織,包括性腺(雌和雄)和肌肉,分別勻漿后待用。

    1.3.2 蝦蛄可食組織中無(wú)機(jī)態(tài)鎘離子的測(cè)定

    蝦蛄可食組織中無(wú)機(jī)鎘的測(cè)定采用HPLC-ICP-MS方法[16],液相色譜分離選用Dionex IonPac CS5A(4 mm×250 mm)陽(yáng)離子交換色譜柱及保護(hù)柱CG5A(4 mm×50 mm);流動(dòng)相組成為50 mmol/L草酸、95 mmol/L氫氧化鋰(pH 4.8)溶液,使用前經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣15 min。稱取1.000 g蝦蛄可食組織置于50 mL塑料刻度離心管中,加入15 mL浸提液,浸提液組成為10 mmol/L Tris緩沖溶液與0.1 mol/L NaCl混合液(pH 7.5),均質(zhì)機(jī)混勻后,超聲提取40 min,8 000 r/min離心10 min,取出上清液用0.45 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾,移入進(jìn)樣瓶中,上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)鎘離子的值。

    1.3.3 蝦蛄可食組織中砷的形態(tài)分析

    參考GB/T 23372—2009《食品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[17],采用HPLCICP-MS聯(lián)用技術(shù)。液相色譜柱為陰離子保護(hù)柱IonPac AG 19(50 mm×4 mm)和陰離子分析柱IonPac AS 19(250 mm×4 mm);流動(dòng)相:A相組成為10 mmol/L無(wú)水乙酸鈉、3 mmol/L硝酸鉀、2 mmol/L磷酸二氫鈉,0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、4%氫氧化鈉調(diào)pH 10.7溶液,B相組成為無(wú)水乙醇,A-B(9∶1,V/V)。取蝦蛄可食組織約1.000 g,加入15 mL超純水,渦旋混勻后,超聲提取40 min,以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后,吸取上清液過(guò)0.45 μm濾膜,濾液注入HPLC-ICP-MS聯(lián)用儀對(duì)AsB、As(III)、As(V)、MMA和DMA不同形態(tài)的砷進(jìn)行定性和定量分析。

    1.3.4 蝦蛄可食組織中總鎘和總砷含量檢測(cè)

    樣品中總鎘和總砷的含量采用ICP-MS測(cè)定。準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品于微波消解罐中,加入8 mL濃HNO3浸泡24 h后,采用微波消解儀進(jìn)行消解和趕酸,程序見(jiàn)表1。冷卻至室溫后,用超純水定容至25 mL,混勻備測(cè),同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

    表 1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedures

    采用ICP-MS測(cè)定消化液中總鎘和總砷的含量,測(cè)定過(guò)程中在線加入10 ng/mL103Rh為內(nèi)標(biāo)元素用于校正儀器響應(yīng)信號(hào)的變化。ICP-MS儀器條件:射頻功率1 500 W、射頻電壓1.20 V、等離子體氣流量15 L/min、載氣流量0.92 L/min、重復(fù)3 次。以待測(cè)元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)元素與103Rh響應(yīng)信號(hào)值的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024為質(zhì)控樣品保證鎘和砷檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    結(jié)果用 ±s表示,采用SPSS 13.0進(jìn)行相關(guān)性分析,P<0.05,差異顯著,采用Sigma Plot 12.5作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蝦蛄可食組織中總鎘及無(wú)機(jī)鎘的分布特征

    表 2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中總鎘含量(n=3)Table 2 Total cadmium concentration in certified reference materials (n= 3)

    表 3 蝦蛄可食組織中總鎘和無(wú)機(jī)鎘的含量(n=3)Table 3 Contents of total cadmium and inorganic Cd2+ in the edible tissues of O. oratoria (n= 3)

    采用本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024中鎘的含量見(jiàn)表2,2 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的實(shí)測(cè)值均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi),且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均較低,說(shuō)明本方法測(cè)定樣品中鎘的含量準(zhǔn)確度高、精密度好。

    分別對(duì)雌、雄蝦蛄肌肉與性腺組織中的總鎘含量進(jìn)行分析可見(jiàn),蝦蛄可食組織中總鎘的含量較高,且性腺中總鎘的含量遠(yuǎn)高于肌肉組織(表3)。樣品性腺中鎘最高含量為44.2 mg/kg,約為肌肉組織的10 倍。肌肉組織中鎘的最低含量為1.62 mg/kg,遠(yuǎn)超出現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值(0.5 mg/kg)的范圍。另外,研究表明總鎘含量與蝦蛄的雌雄性別無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

    圖 1 HPLC-ICP-MS分析蝦蛄可食組織中無(wú)機(jī)鎘離子譜圖Fig. 1 Chromatograms of Cd2+ in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

    從圖1可見(jiàn),性腺中無(wú)機(jī)鎘離子含量遠(yuǎn)高于肌肉組織。對(duì)所有樣品中無(wú)機(jī)鎘離子含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)(表3),大部分樣品無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘占總鎘百分比的20%以下,相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)所有組織中無(wú)機(jī)鎘含量與總鎘含量之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.001),即總鎘含量越高的樣品或組織中其無(wú)機(jī)鎘含量也較高。所有肌肉組織中無(wú)機(jī)鎘含量均遠(yuǎn)低于1.0 mg/kg,11 份樣品中,有7 份樣品肌肉組織中無(wú)機(jī)鎘含量低于0.50 mg/kg,而性腺中無(wú)機(jī)鎘含量較高,均超出1.0 mg/kg。

    2.2 蝦蛄不同組織中總砷及砷形態(tài)的含量分布特征

    表 4 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中總砷含量(n=3)Table 4 Total arsenic concentration in certified reference materials (n= 3)

    質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024中總砷的含量分析見(jiàn)表4,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的實(shí)測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi),且RSD較低,說(shuō)明本研究采用的ICP-MS法測(cè)定水產(chǎn)品中總砷的含量準(zhǔn)確度高、精密度好,適合于蝦蛄中總砷的測(cè)定。

    對(duì)蝦蛄不同組織中總砷及4 種主要有毒砷形態(tài)的含量分析見(jiàn)表5。蝦蛄中總砷含量較高,且性腺中總砷含量普遍高于肌肉組織,但與雌雄性別無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

    表 5 蝦蛄可食組織中總砷和4 種主要砷形態(tài)含量(n=3)Table 5 Concentrations of total arsenic and four arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria (n= 3) mg/kg

    圖 2 HPLC-ICP-MS砷形態(tài)分析譜圖Fig. 2 Chromatograms of different arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

    采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)可以很好地分離蝦蛄組織中As的5 種不同形態(tài)(圖2)。對(duì)蝦蛄不同組織中砷形態(tài)進(jìn)行分析可見(jiàn),所有蝦蛄樣品中均檢出As(III)和As(V),其中肌肉組織中無(wú)機(jī)砷的含量最高,為0.46 mg/kg,性腺中無(wú)機(jī)砷的含量最高,為1.04 mg/kg。相關(guān)性分析得出所有樣品各可食組織中無(wú)機(jī)砷的含量與總砷之間無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。肌肉組織中無(wú)機(jī)砷占總砷百分比非常低,范圍為1.71%~6.14%。除無(wú)機(jī)砷外,還從部分樣品中檢出少量的MMA和DMA。有機(jī)砷形態(tài)AsB是蝦蛄所有可食組織中的主要砷形態(tài),其占總砷的75.0%~95.7%,平均值為88.1%。

    3 討 論

    水生生物極易富集環(huán)境中的鎘,如貝類可富集105~106倍,且鎘可沿食物鏈轉(zhuǎn)移蓄積[18],本研究結(jié)果表明蝦蛄對(duì)鎘具有較強(qiáng)的富集能力。蝦蛄中鎘的含量較高已有報(bào)道[12],但針對(duì)可食組織中鎘的分布特征鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析可食組織中鎘的分布特征,發(fā)現(xiàn)肌肉組織中鎘的含量遠(yuǎn)低于可食的性腺組織,但是按照現(xiàn)行GB 2762—2017《食品中污染物限量》中針對(duì)甲殼類中鎘的限量要求為0.5 mg/kg,在本實(shí)驗(yàn)中采集的蝦蛄樣品肌肉組織中鎘的超標(biāo)率為100%。鎘離子進(jìn)入生物體內(nèi)可以與蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等結(jié)合成比較穩(wěn)定的有機(jī)鎘形態(tài)存在,只有少部分的鎘在體內(nèi)以無(wú)機(jī)離子態(tài)存在[19]。研究表明與蛋白結(jié)合的鎘(即有機(jī)態(tài)鎘)對(duì)細(xì)胞毒性明顯低于無(wú)機(jī)離子態(tài)的鎘[20],因此若簡(jiǎn)單地僅分析鎘的總含量,并以其離子態(tài)的毒性效應(yīng)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)會(huì)高估其毒害效應(yīng)。課題組在前期運(yùn)用體積排阻色譜-HPLC-ICP-MS分析了蝦蛄肌肉組織中鎘的有機(jī)形態(tài)主要以鎘-金屬硫蛋白形態(tài)存在[21],本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用HPLCICP-MS技術(shù)分析可食肌肉組織與性腺組織中無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘的含量,該方法采用中性鹽緩沖體系為浸提液,能夠最大可能保持蝦蛄組織中鎘的原始形態(tài)不變,通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱的吸附洗脫完成對(duì)無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘的分離和測(cè)定[16],分析結(jié)果表明肌肉組織與性腺組織中無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘的含量較低,且無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘占總鎘的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)較低,進(jìn)一步表明鎘主要以有機(jī)形態(tài)存在于蝦蛄可食組織中。

    本研究表明按照GB 2762—2017《食品中污染物限量》中甲殼類重金屬鎘的限量要求,蝦蛄可食組織中鎘的超標(biāo)情況比較嚴(yán)重。截止目前,關(guān)于甲殼類中重金屬鎘的安全限量值,不同國(guó)家有自己不同的標(biāo)準(zhǔn),如歐盟限定甲殼類動(dòng)物鎘限量值為0.5 mg/kg,美國(guó)限定甲殼類中鎘限量值為3.0 mg/kg,韓國(guó)限量值為2.0 mg/kg[22],由此可見(jiàn),我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)限量值相對(duì)比較嚴(yán)格。針對(duì)蝦蛄這種具有高富集鎘特性的甲殼類品種,開(kāi)展鎘的標(biāo)準(zhǔn)限量再評(píng)價(jià),制定一個(gè)更為科學(xué)合理的標(biāo)準(zhǔn)限量值更具意義。本研究結(jié)果證明了蝦蛄可食組織中毒性最高的無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘含量較低,下一步的重點(diǎn)工作應(yīng)在鎘形態(tài)分析的研究基礎(chǔ)上,聚焦鎘的生物利用率即探究蝦蛄中鎘的內(nèi)暴露劑量(被機(jī)體攝入后經(jīng)過(guò)消化、吸收而達(dá)到組織產(chǎn)生毒性作用的劑量),因?yàn)榛谖廴疚飪?nèi)暴露劑量進(jìn)行的膳食暴露評(píng)估結(jié)果制定的限量標(biāo)準(zhǔn)值才更科學(xué)、更合理[23]。

    魚(yú)類、甲殼類和貝類等水產(chǎn)品是人類膳食優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源之一,同時(shí)也是人體攝入砷的一種重要來(lái)源,研究表明人們?nèi)粘o嬍持屑s90%的砷來(lái)自于水產(chǎn)品[24]。本研究發(fā)現(xiàn)蝦蛄可食組織中總砷含量較高,肌肉組織與性腺中總砷的含量分別與已報(bào)道的具有較強(qiáng)砷富集能力的三疣梭子蟹肌肉與性腺中的含量相近[25],說(shuō)明蝦蛄對(duì)砷具有較高的富集能力。砷的形態(tài)分析表明蝦蛄可食組織中含有多種不同形態(tài)的砷。國(guó)際癌癥研究中心確認(rèn)無(wú)機(jī)砷及其化合物為I級(jí)致癌物質(zhì),MMA和DMA被歸為潛在的致癌物質(zhì)[26]。As(III)是毒性最強(qiáng)的砷化合物,進(jìn)入人體后,能與人體內(nèi)帶巰基的酶蛋白結(jié)合,干擾細(xì)胞的生物功能、結(jié)構(gòu)和正常代謝,產(chǎn)生毒性效應(yīng),As(V)主要是取代磷酸,競(jìng)爭(zhēng)磷酸化偶聯(lián)而產(chǎn)生毒性,DMA和MMA在酶的作用下會(huì)脫去甲基形成自由基,促使脂質(zhì)氧化,損害膜細(xì)胞[27]。蝦蛄可食組織中無(wú)機(jī)砷的檢出率較高,在所采集的樣品中,肌肉組織中無(wú)機(jī)砷的檢出率為100%,但是其含量均未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017中無(wú)機(jī)砷的限量要求(0.5 mg/kg),且無(wú)機(jī)砷占總砷的百分含量非常低。雖然有一個(gè)樣品的性腺組織中無(wú)機(jī)砷的含量超出了限量要求,但是由于性腺占可食部分的質(zhì)量百分比非常低,因此對(duì)蝦蛄可食組織的無(wú)機(jī)砷風(fēng)險(xiǎn)影響極低。另外,在可食組織中也檢出了低量的DMA和MMA,且其分布沒(méi)有明顯的雌雄差異和組織差異。雖然蝦蛄可食組織中存在一定量的無(wú)機(jī)砷、DMA和MMA,但是通過(guò)圖2也可見(jiàn),大分子的有機(jī)砷化合物(AsB)是蝦蛄可食組織中主要的砷形態(tài)。DMA是海洋生物中最主要的甲基砷化合物,而MMA含量較少,AsB是海洋生物中最主要的水溶性砷形態(tài)[28]。研究表明AsB化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒。在人體和其他哺乳動(dòng)物中未發(fā)生轉(zhuǎn)化便被排泄出體外,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明AsB不能使哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生誘導(dǎo)突變,無(wú)細(xì)胞毒性、免疫毒性和生殖毒性,常被視為無(wú)毒的有機(jī)砷形態(tài)[29],因此考察蝦蛄中砷含量危害時(shí),應(yīng)該考慮砷存在形態(tài)問(wèn)題。

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