鮮切蓮藕腐敗的熒光檢測方法

劉永樂，唐 倩，俞 健，劉小芳，陳善輝，李 彥，王發(fā)祥

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114）

蓮藕營養(yǎng)成分豐富、口感微甜而脆，同時又可消食止瀉、開胃清熱、滋補養(yǎng)性，是優(yōu)良的水生蔬菜和副食佳品，深受廣大消費者喜愛[1-2]。我國是蓮藕產(chǎn)銷大國，近年來產(chǎn)銷量均持續(xù)增長，2017 1 122.2萬 t，居世界前茅。目前我國蓮藕消費仍以鮮食為主，加工比例僅約5%，深加工領(lǐng)域發(fā)展空間較大。鮮切蓮藕是將新鮮蓮藕進(jìn)行清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等加工流程后得到的即食或即用蓮藕制品，因其具有清潔、衛(wèi)生、新鮮和方便等特點而十分暢銷[3-5]，已成為我國蓮藕加工的主要方式。然而，蓮藕水分含量高，加之加工過程中的去皮、切分等工序使其細(xì)胞受損，導(dǎo)致其生理生化反應(yīng)加劇、容易發(fā)生微生物侵染，極易腐敗變質(zhì)[5-6]，嚴(yán)重影響到其質(zhì)量與安全。因此，研究準(zhǔn)確評價鮮切蓮藕產(chǎn)品是否腐敗變質(zhì)的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

食品變質(zhì)腐敗泛指在微生物為主的各種因素作用下，食品降低或失去食用價值的一切變化，是一個復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程[7-8]。因此，目前尚無統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)和檢驗方法，主要借助微生物菌落總數(shù)、致病菌等傳統(tǒng)的衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行檢驗[9-10]。然而，傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢驗方法具有操作復(fù)雜、專業(yè)性較強、檢驗周期較長、特異性較弱等缺點[11-14]，不能滿足鮮切果蔬產(chǎn)品便捷檢測的需求，急需建立一種方便快捷的檢測方法。熒光檢測具有靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品安全檢測領(lǐng)域[15-17]，但利用熒光指示菌表征果蔬產(chǎn)品微生物腐敗的研究報道較少。

關(guān)于蓮藕制品貯藏過程中的微生物污染和腐敗分析，目前的研究主要集中在其優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定[6,18-19]、產(chǎn)品貨架期預(yù)測模型[20-21]等方面，而針對其腐敗變質(zhì)快速檢測或評價方法的研究較少。在前期研究中，課題組基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)對鮮切蓮藕冷藏過程中微生物菌相結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，明確了兩種能自發(fā)產(chǎn)生熒光的特異腐敗菌Pseudomonas fluorescens和P. asturiensis可作為潛在的腐敗指示菌用于鮮切蓮藕產(chǎn)品質(zhì)量安全的評價和快速檢測研究[22]。本研究在此基礎(chǔ)上，根據(jù)該指示菌自發(fā)熒光的特性，建立一種基于熒光顯影檢測鮮切蓮藕產(chǎn)品微生物腐敗的方法，并進(jìn)行檢測條件的優(yōu)化、驗證和相關(guān)性分析，以期為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全評價和便捷檢測新技術(shù)開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕：成熟度適中，藕節(jié)完整，無機械傷的帶泥蓮藕，購自本地農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場；大腸桿菌（Escherichia coliBL21），由本實驗室保藏。

金氏B（KB）培養(yǎng)基[23]、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

C2 Plus激光掃描共聚焦顯微鏡 日本尼康公司；Champ Ge15000增強型全自動凝膠成像儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮切蓮藕樣品及其懸液制備

新鮮蓮藕按文獻(xiàn)[20]方法切片后置于4 ℃冰箱中冷藏，分別于第0、3、6、9、12天從冰箱取出，在無菌條件下稱取25 g，剪碎（大小約5 mm×5 mm），加入225 mL無菌生理鹽水中，于恒溫振蕩器以25 ℃、120 r/min振蕩15 min制成樣品懸液，用于后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.2 微生物菌落總數(shù)測定

按照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》方法進(jìn)行。

1.3.3 指示菌自發(fā)熒光實驗

稱取適量KB培養(yǎng)基，按使用說明加入蒸餾水和適量甘油，加熱溶解、滅菌后傾注平板。待固體平板冷卻后，用接種環(huán)分別點接種對照組（大腸桿菌培養(yǎng)液）和3 個平行實驗組（系列蓮藕懸液樣品），于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，分別于可見光和紫外光下觀察結(jié)果。

1.3.4 激光共聚焦顯微鏡測定樣品懸液熒光強度

分別取冷藏0、3、6、9、12 d的蓮藕樣品懸液及冷藏第6天的蓮藕懸液稀釋10、100、1 000、10 000 倍，用微量移液槍移取2 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片以激光共聚焦顯微鏡檢測其熒光強度，其中熒光激發(fā)波長為405 nm，電壓為105 V，激發(fā)器輸出功率為14%；標(biāo)本在不同視野進(jìn)行拍攝，將圖片分為強、中、弱3 個等級，選取中等強度的視野代表該樣品的熒光強度[24]，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的熒光值表示，計算平均值。

1.3.5 熒光指示菌的便捷檢測方法建立

取不同冷藏時間點的蓮藕樣品懸液，用接種環(huán)劃線接種至KB培養(yǎng)基斜面試管，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，利用凝膠成像系統(tǒng)的紫外模式觀察熒光并拍照，根據(jù)檢測到的熒光情況與樣品菌落總數(shù)的對應(yīng)關(guān)系驗證利用熒光指示菌檢測樣品腐敗的可行性。每一樣品接種3 支斜面，同時接種1 支大腸桿菌斜面作為陰性對照。

1.3.6 熒光檢測條件的優(yōu)化

取不同冷藏時間點的蓮藕樣品懸液，分別稀釋0、2.5、5、10、20 倍，用微量移液槍移取10 μL至KB培養(yǎng)基斜面，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后拍照，以樣品圖像的積分光密度（integrated optical density，IOD）平均值表示熒光強度，根據(jù)IOD值變化規(guī)律篩選合適懸液稀釋比例；懸液按最佳比例稀釋后，分別接種5、10、15、20、25 μL，按同樣的條件分析計算其IOD值，篩選最佳接種量。

1.3.7 熒光檢測方法的驗證

按1.3.1節(jié)方法制備鮮切蓮藕樣品（30 袋），分別在冷藏第0、5、6、7天隨機取樣制備懸液，按1.3.5節(jié)的最優(yōu)條件進(jìn)行熒光檢測，根據(jù)熒光信號是否檢出判定樣品是否腐敗；同時按傳統(tǒng)的菌落總數(shù)指標(biāo)法檢測樣品是否腐敗，驗證熒光檢測方法的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗進(jìn)行3～6 個平行，以 ±s表示，以Microsoft Excel軟件計算并繪制結(jié)果圖；激光共聚焦顯微鏡測定的DAPI值采用Leica LSCM軟件計算，KB培養(yǎng)基法獲得的照片采用Gel-Pro Analyzer軟件分析計算IOD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切蓮藕冷藏過程中菌落總數(shù)的變化

圖 1 鮮切蓮藕冷藏過程中菌落總數(shù)變化Fig. 1 Changes in total colony count of lotus root samples during cold storage

如圖1所示，冷藏過程中菌落總數(shù)一直呈增長趨勢，新鮮（第0天）樣品為2.1×103CFU/g，冷藏前3 d增加緩慢；此后菌落總數(shù)增長加快，第6天時達(dá)6.4×104CFU/g。根據(jù)浙江大學(xué)食品科學(xué)與發(fā)酵工程研究所2005年起草的《蔬菜（凈菜）質(zhì)量安全要求》，要求其菌落總數(shù)不得超過5×104CFU/g，因此可以認(rèn)為樣品在冷藏第6天時已開始腐敗變質(zhì)；冷藏第9天后，樣品菌落總數(shù)開始急劇增加，至第12天時已達(dá)到4.3×105CFU/g，表明已嚴(yán)重腐敗。

2.2 自發(fā)熒光指示菌的確認(rèn)

圖 2 蓮藕樣品懸液接種KB培養(yǎng)基的熒光檢測顯影結(jié)果Fig. 2 Fluorescence detection of the bacterial colonies in KB plate from different lotus root samples

在前期研究中，課題組通過PCR-DGGE技術(shù)研究了冷藏期間蓮藕的優(yōu)勢腐敗菌類型和菌相結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細(xì)菌在腐敗關(guān)鍵期開始大量增殖，逐漸成為優(yōu)勢腐敗菌，可以作為評價鮮切蓮藕產(chǎn)品是否腐敗的重要指示菌；尤其是優(yōu)勢腐敗菌P. asturiensis的檢出時間與腐敗時間一致[22]，且可產(chǎn)生水溶性黃綠色熒光色素[25-26]，可以通過熒光顯影技術(shù)檢測[15]。

如圖2所示，第0、3天樣品懸液接種后沒有在KB平板上長出明顯菌落，可能與懸液中微生物數(shù)量較少有關(guān)；第6天后的樣品才開始長出菌落，且在可見光下呈黃綠色，但對照菌液接種后一直為灰白色菌落。將平板置于紫外光下，在接種第6～12天樣品處可觀察到明顯的熒光，對照菌則不會產(chǎn)生熒光，說明熒光的產(chǎn)生與蓮藕樣品的腐敗菌有關(guān)。此外，樣品檢測出熒光的時間與DGGE圖譜[22]中P. asturiensis出現(xiàn)的時間一致，也與通過菌落總數(shù)指標(biāo)判定蓮藕樣品腐敗變質(zhì)的時間一致。因此，理論上通過檢測熒光表征樣品腐敗變質(zhì)可行。

2.3 熒光強度與微生物數(shù)量的關(guān)系

表 1 不同冷藏時間和稀釋度蓮藕樣品懸液的DAPI值Table 1 Fluorescence intensities of suspension cultures of lotus root samples with different cold storage times and dilution factors

激光掃描共聚焦顯微鏡可以定量檢測生物體自發(fā)熒光強度[27-28]。如圖3所示，隨著蓮藕冷藏時間的延長，樣品懸液的熒光強度逐漸增強，尤其是第6天后熒光強度急劇上升，至第12天時達(dá)到最強（圖3A、表1），說明樣品懸液中熒光指示菌產(chǎn)生的熒光強度與其冷藏過程中菌落總數(shù)（圖1）的變化趨勢基本一致。由于蓮藕樣品在冷藏第6天開始腐敗，將冷藏6 d的蓮藕樣品懸液稀釋后進(jìn)行激光共聚焦熒光檢測。樣品原液的熒光強度最強，隨著稀釋度的增加，熒光強度逐漸減弱（圖3B、表1），說明熒光強度與指示菌數(shù)量間具有一定的正相關(guān)關(guān)系，可以根據(jù)指示菌的熒光強度表征樣品的微生物污染程度，從而直觀地分析其腐敗情況[29]。

2.4 熒光檢測方法的建立

激光共聚焦熒光檢測可以較好地根據(jù)指示菌的熒光強度表征樣品的微生物腐敗程度，但受限于激光掃描共聚焦顯微鏡的購置和檢測成本，目前采用該方法檢測鮮切蓮藕樣品微生物腐敗仍不現(xiàn)實。因此，需要發(fā)展一種相對經(jīng)濟(jì)又便捷的熒光指示菌檢測方法。圖4為不同冷藏時間的蓮藕樣品懸液接種KB斜面后利用凝膠成像系統(tǒng)照相獲得的照片。各組陰性對照的斜面試管（第4支）均無熒光產(chǎn)生，樣品試管從冷藏第6天開始檢測到熒光，這一時間點與圖1的結(jié)論（開始腐敗的時間點為第6天）吻合。因此，可以用樣品熒光指示菌的檢出表征樣品的微生物腐敗，該方法較激光共聚焦檢測更實惠，同時較傳統(tǒng)衛(wèi)生指標(biāo)檢測法更簡單快捷。然而，可能由于劃線接種量的不確定性，樣品的熒光強度與其微生物菌落總數(shù)的線性對應(yīng)關(guān)系還不理想，尚需對其熒光檢測條件進(jìn)一步優(yōu)化。

圖 4 不同蓮藕樣品懸液接種KB斜面后的熒光檢測結(jié)果Fig. 4 Fluorescence detection of suspension cultures of different lotus root samples inoculated on KB slopes

2.5 熒光檢測條件的優(yōu)化

2.5.1 稀釋度的選擇

圖 5 不同稀釋度蓮藕懸液接種KB斜面后的熒光檢測結(jié)果Fig. 5 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples with different dilution factors inoculated on KB slopes

如圖5所示，對照和第0天樣品斜面試管均無熒光產(chǎn)生，而冷藏6 d以后樣品的各稀釋度斜面均檢測到熒光，且強度基本隨冷藏時間的延長逐漸增強，再次印證了利用指示菌熒光檢測表征樣品微生物腐敗的可行性；然而，原液和稀釋2.5、5 倍的第3天樣品各有1 支試管檢測到微弱熒光，說明不合適的樣品懸液稀釋度可能會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，后續(xù)選取稀釋10 倍作為最佳稀釋度。

2.5.2 接種量的確定

在不同蓮藕樣品均稀釋度懸液均稀釋10 倍的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同接種量實驗，斜面培養(yǎng)后的熒光檢測結(jié)果如圖6所示。接種量為5、10 μL的樣品均第6天開始出現(xiàn)熒光，且隨著接種量的增加，熒光強度逐漸增強；而接種量大于15 μL后，冷藏第3天樣品試管也能檢測到熒光，說明接種量太大造成假陽性結(jié)果。分析計算接種5 μL和10 μL實驗組樣品圖像的IOD值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量為5 μL時其與冷藏時間的相關(guān)性更好（圖7）。因此，最終確定樣品懸液稀釋10 倍、接種量5 μL為熒光指示菌便捷檢測方法的最優(yōu)條件。

圖 6 不同接種量蓮藕懸液于KB斜面培養(yǎng)后的熒光檢測結(jié)果Fig. 6 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples at different inoculum amounts inoculated on KB slopes

圖 7 最佳檢測條件下的樣品IOD值與冷藏時間的關(guān)系Fig. 7 Relationship between cold storage time of lotus root samples and fluorescence intensity under optimal conditions

2.6 檢測方法的驗證

隨機選取10 個不同凍藏時間的鮮切蓮藕樣本，分別以本研究的熒光檢測方法和傳統(tǒng)的微生物菌落總數(shù)分析法進(jìn)行樣品微生物腐敗檢測對比，結(jié)果如表2所示。除冷藏第5天的樣品檢測到微弱熒光外（導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與樣品腐敗菌的個體差異和稀釋或接種操作有關(guān)[30]），其余樣品均與傳統(tǒng)方法檢測的結(jié)果一致，準(zhǔn)確率高達(dá)90%，說明本研究建立的利用熒光指示菌檢測鮮切蓮藕腐敗的方法可行。

表 2 熒光檢測法與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果比對Table 2 Comparison of the results of fluorescence detection and traditional detection methods

3 結(jié) 論

本研究基于前期PCR-DGGE技術(shù)明確了鮮切蓮藕冷藏過程中優(yōu)勢腐敗菌P. asturiensis的檢出時間與腐敗時間點的一致性，應(yīng)用其自發(fā)熒光的特點建立了一種基于熒光顯影表征鮮切蓮藕產(chǎn)品微生物腐敗情況便捷檢測方法。通過熒光指示菌的確認(rèn)、熒光強度與微生物數(shù)量的相關(guān)性分析、熒光檢測方法建立及其檢測條件的優(yōu)化，最終對實際樣品腐敗檢測的驗證結(jié)果與傳統(tǒng)菌落總數(shù)檢驗方法基本一致。與傳統(tǒng)微生物衛(wèi)生指標(biāo)檢驗方法相比，該熒光檢測方法操作簡便、結(jié)果直觀，而且檢出準(zhǔn)確率高，是一種便捷可行的蓮藕腐敗檢測方法。