菜肴中3-氯-1,2-丙二醇及其酯的含量分析

張璟琳，劉廷竹，黃明泉,*，孫寶國

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloro-1,2-propanediol，3-MCPD）于1978年的食品加工中的酸水解植物蛋白中被發(fā)現(xiàn)[1]，之后又在多種食品中檢測到。2004年，3-MCPD及其酯類在多種精煉油脂中被發(fā)現(xiàn)[2]。因為3-氯-1,2-丙二醇酯（3-MCPD酯）含量超出3-MCPD幾十倍，所以隨后3-MCPD酯的研究引起了廣泛關(guān)注。研究表明3-MCPD酯可被腸道吸收，從而產(chǎn)生毒性[3]，除此3-MCPD酯本身也具有毒性，有研究指出3-MCPD酯類化合物對腎臟和睪丸具有毒性[4-5]，同時對大腦和潛在的神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性[6-7]。然而在食品中3-MCPD酯含量遠高于3-MCPD[8]，所以客觀評價3-MCPD酯對消費者潛在的健康危害風險非常重要。目前我國僅對3-MCPD在調(diào)味品中的含量進行了限量，在固態(tài)調(diào)味品中低于1 mg/kg，在液態(tài)調(diào)味品中低于0.02 mg/kg[9]聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會提出的暫定每日最大耐受攝入量（provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）為2 μg/（kg·d）[10]。

為測定食品中3-MCPD酯的含量，很多研究者對其檢測方法進行優(yōu)化。3-MCPD酯的檢測方法主要分為直接法和間接法。目前多采用間接法，間接法一般分為以下幾步[11]：樣品中添加內(nèi)標物，酯交換（通常在酸性[12-13]或堿性[14]條件下進行），中和混合液并鹽析，衍生化反應后進入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）聯(lián)用儀分析。直接法是將樣品除雜富集后直接用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀[15]、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜[15]分析。Dubois等[16]將直接法和間接法進行了對比，發(fā)現(xiàn)2 種方法定量結(jié)果無顯著差異，但是間接法需要的標準品更少，且適用于不同類型的植物油，所以常規(guī)檢測更推薦利用間接法。Hrncirik等[17]對不同酯交換條件進行探索，3-MCPD在堿性條件下3-MCPD不穩(wěn)定[18]，而在酸性條件較穩(wěn)定[19]。

對于食品中3-MCPD及3-MCPD酯的含量多有報道[20]，Vicente等[21]檢測了232 種樣品，發(fā)現(xiàn)醬油中3-MCPD含量較高，為4 405 μg/kg，面包（716 μg/kg）、煙熏食品（49 μg/kg）中含量較低。Becalski等[22]對加拿大市場食品中氯丙醇酯含量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，核桃、米糠、葡萄籽油和棕櫚油中的含量較高。Ilko等[23]分析了炸薯條中3-MCPD酯含量為654～1 920 μg/kg。韓楓[24]檢測了125 份植物油，其中棕櫚油中3-MCPD酯與2-MCPD酯含量普遍較高，含量范圍分別2.23～3.16 mg/kg和1.32～1.99 mg/kg。里南[25]對我國的食用油、方便面、油炸食品進行檢測，結(jié)果表明油炸食品中氯丙醇酯的污染較為嚴重，3-MCPD酯和2-MCPD酯含量為0.064～7.67 mg/kg和0.072～5.02 mg/kg。

目前對于菜肴中3-MCPD酯含量的研究還鮮見報道。本實驗對我國菜肴中的3-MCPD酯含量進行分析，將有助于了解我國飲食中3-MCPD酯的污染程度，為制定我國飲食中3-MCPD酯的最大每日耐受攝入量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆芽炒肉、蒜苔炒肉、菠菜炒雞蛋、炒土豆片、醬炒土豆片、白菜粉條、清炒圓白菜、清炒冬瓜、西紅柿炒雞蛋、海帶炒肉、宮保雞丁、脆皮豆腐羊肉、清炒花菜 食堂（替代家庭烹調(diào)）；農(nóng)家小炒肉、小炒木耳、青椒炒肉、魚香肉絲、杏鮑菇炒肉、宮保雞丁、干煸豆角、炒雞鴨雜、小炒黃牛肉、炸雞塊、干炸小黃魚、土豆塊炒魚豆腐、炸土豆條、糖醋里脊、干鍋土豆、干鍋有機花菜、干鍋娃娃菜、干鍋圓白菜、紅燒茄子、小黃魚燒豆腐、土豆燒排骨、土豆燒雞肉、西紅柿燉牛腩、大白菜燉豆腐、杏鮑菇燉山雞 餐館。

乙醚、正己烷、四氫呋喃、無水硫酸鈉（650 ℃灼燒4 h）、碳酸氫鈉（均為分析純），硅藻土（化學純）國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸（化學純）北京化工廠；2,2,4-三甲基戊烷、甲醇（均為色譜純）北京百靈威科技有限公司；七氟丁酰基咪唑（heptafluorobutyrylim idazole，HFBI，分析純）、3-MCPD（純度＞98%） 東京化成工業(yè)株式會社；D5-3-MCPD 加拿大Toronto Research Chemicals公司；1,2-二棕櫚酸氯丙醇酯（1,2-bispalmitoyl-3-chloropropanediol，PP-3-MCPD，99.5%）、D5-1,2-二棕櫚酸氯丙醇酯（D5-1,2-bispalmitoyl-3-chloropropanediol，D5-PP-3-MCPD）瑞士Chiron公司。

1.2 儀器與設備

玻璃層析柱（柱長305 mm，內(nèi)徑26 mm） 北京欣維爾玻璃儀器有限公司；QL-901渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造公司；精密微量移液器（200、1 000 μL、10 mL） 北京吉爾森科技有限公司；KQ-2500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WG9220A電熱鼓風干燥箱 天津市通利信達儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；BF-2000氮氣吹干儀 北京八方世紀科技有限公司；1 mL氣密針 美國Agilent公司；TRACE 1310-TSQ8000 GC-MS/MS儀 美國Thermo Fisher公司；JYL-C012食物打碎機 九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

3-MCPD標準溶液配制：用四氫呋喃稀釋至10.00 μg/mL，依次稀釋至質(zhì)量濃度為0.010、0.020、0.050、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL；PP-3-MCPD標準溶液配制：各采用四氫呋喃分別稀釋至2.00、5.00、10.00 μg/mL；D5-PP-3-MCPD及D5-3-MCPD內(nèi)標溶液配制：各采用四氫呋喃稀釋至5.00 μg/mL。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 3-MCPD樣品制備

將菜肴于打碎機中打成勻漿，之后準確稱取試樣4.000 g于100 mL燒杯中，加入6 g飽和氯化鈉溶液，加入D5-3-MCPD內(nèi)標溶液40 μL，超聲15 min。

3-MCPD的提?。合蛐屑?.00 g硅藻土，玻璃棒攪拌均勻。裝入已依次填充少許玻璃棉、2 cm高無水硫酸鈉和8.00 g硅藻土的玻璃層析柱中。壓實后上層再充填2 cm高無水硫酸鈉。靜置15 min后，用乙醚150 mL洗脫3-MCPD，洗脫速率約為5 mL/min。250 mL圓底燒瓶收集，收集完成后，向燒瓶中加入25 g無水硫酸鈉干燥，過夜。過濾，25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后定容至4.0 mL。

衍生化反應：向4.0 mL試樣中加入約2.000 g無水硫酸鈉，干燥15 min。移取2.0 mL于5 mL具塞刻度試管中，氮氣吹至近干，加入1.0 mL 2,2,4-三甲基戊烷，用氣密針立即加入60 μL HFBI，立即密封。渦旋混合后于70 ℃油浴加熱20 min。取出后，放置室溫，加3.0 mL飽和氯化鈉溶液；渦旋振蕩30 s，使兩相分離。取有機相加無水硫酸鈉約為0.300 g干燥。將溶液轉(zhuǎn)移至自動進樣的樣品瓶中，供GC-MS/MS測定。1.3.2.2 3-MCPD酯樣品制備

3-MCPD酯的提取：取試樣2.000 g加入到50 mL離心管中，加入內(nèi)標物D5-PP-3-MCPD溶液40 μL。加入正己烷10 mL，渦旋振蕩2 min，超聲5 min，離心10 min，將萃取液轉(zhuǎn)入另一個離心管中。相同萃取操作3 次。然后加5 mL蒸餾水，將萃取液中的氯離子洗去，重復3 次。

酯交換反應：將萃取液轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，轉(zhuǎn)移至放有磁力轉(zhuǎn)子的厚壁耐壓管中，氮氣吹至接近干，加入2 mL四氫呋喃，加入1.8 mL 0.33 mol/L的硫酸甲醇溶液，并于60 ℃反應12 h。向酯交換反應后的試樣中加入0.50 mL飽和碳酸氫鈉調(diào)制中性，終止反應，然后氮吹，以除去四氫呋喃，加入1.0 mL去離子水，再加入1.0 mL正己烷，重復萃取3 次，以除去酯交換反應生成的脂肪酸甲酯。然后將萃取后的水相轉(zhuǎn)移到100 mL小燒杯中，用1.0 mL乙醚清洗反應管，重復3 次，向小燒杯中加3.0 mL飽和食鹽水，以促進3-MCPD在洗脫劑中的溶解。

3-MCPD的提取、衍生化反應與1.3.2.1節(jié)方法一致。

1.3.3 儀器分析條件

色譜條件：毛細管色譜柱，Rtx-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度260 ℃；載氣氦氣，恒流模式，流速1 mL/min；進樣體積1.0 μL，不分流進樣；升溫程序，初始50 ℃，以20 ℃/min速率升至90 ℃，再以1 ℃/min升至93 ℃，然后以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜參數(shù)：電子電離源，能量為70 eV；傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為280 ℃；碰撞氣氬氣；多離子反應檢測模式。選取m/z為453/169、456/169的離子碎片分別作為3-MCPD衍生物和D5-3-MCPD衍生物的定量離子，其他為輔助定性離子。優(yōu)化后二級質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表 1 二級質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of tandem mass spectrometry

1.4 數(shù)據(jù)處理

內(nèi)標法計算3-MCPD含量（3-MCPD酯含量以3-MCPD質(zhì)量計），公式如下：

式中：X為試樣中3-MCPD含量/（μg/kg）；C為試樣色譜峰峰面積與內(nèi)標物面積比值在標準曲線上對應3-MCPD的含量/μg；V1為衍生前3-MCPD萃取液的定容體積/mL；V2為衍生時3-MCPD萃取液的取樣體積/mL；M為試樣的取樣量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

固定酯交換反應溫度60 ℃，酯交換反應時間分別為8、10、12、14、16 h。按照實驗方法進行凈化、衍生、GC-MS/MS測定，結(jié)果如圖1所示。

圖 1 酯交換反應時間對3-MCPD含量結(jié)果測定的影響Fig. 1 Effects of reaction time on the content of 3-MCPD esters

從圖1可以看出，在酯交換反應時間8～12 h呈上升趨勢，在12～16 h峰面積響應值相對比較穩(wěn)定，所以選擇酯交換反應時間12 h、酯交換反應溫度60 ℃，作為酯交換反應的較優(yōu)條件。

酯交換反應結(jié)束后，直接進行液液萃取，然后過層析柱，發(fā)現(xiàn)每次需要大量的無水硫酸鈉才能夠除盡水分；而將有機溶劑四氫呋喃吹干后，再進行液液萃取，無水硫酸鈉的需求量相對比較小。因為后續(xù)衍生實驗需要無水條件，所以，選擇液液萃取前先將有機溶劑吹干，再進行后期凈化衍生等步驟。

圖 2 3-MCPD衍生物一級質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of 3-MCPD derivatives

目標分子的一級質(zhì)譜碎片離子中豐度最高的是質(zhì)荷比（m/z）為169和69的離子碎片，但是m/z169的離子碎片是[—C3F7]＋、m/z69離子碎片是[CF3]＋，均不是來自氯丙醇，而是HFBI所產(chǎn)生，故不能選m/z169、m/z69離子碎片作為母離子。3-MCPD衍生物所選特征母離子m/z分別為253、275、453；D5-3-MCPD衍生物所選特征母離子m/z分別257、293、456。由于2-MCPD衍生物中也含有253和275離子碎片，而且該離子的二級質(zhì)譜圖也相同，同時在實際樣品中2-MCPD和3-MCPD衍生物的保留時間比較接近，所以3-MCPD衍生物選擇2-MCPD衍生物所不含有的m/z453（169）作為定量離子。同樣D5-3-MCPD衍生物選擇特異性比較好的m/z456（169）作為定量離子。

2.2 分析方法驗證

2.2.1 線性范圍

取10 個不同質(zhì)量濃度（0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L）3-MCPD標準溶液，衍生化后分別進樣。因為質(zhì)量濃度范圍過寬，低質(zhì)量濃度的標準品計算值不穩(wěn)定。所以，在實際測樣品時分別以不同質(zhì)量濃度0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L和不同質(zhì)量濃度0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L各標準系列溶液3-MCPD七氟丁酰衍生物峰響應值與內(nèi)標物響應值的比值（Y）與3-MCPD與其內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值（X）作線性回歸分析。

3-MCPD在0.001 0～0.020 ng和0.020～0.06 ng范圍時，線性回歸方程分別為Y=-0.034 648＋0.070 278 3X，R2=0.997 2和Y=0.176 325＋0.066 762 7X，R2=0.999 5；線性均良好。

2.2.2 回收率與精密度

選取含3 種以上調(diào)味料的菜肴（魚香肉絲）作為代表性樣品，準確稱取2.000 g，分別添加2.000、5.000、10.00 mg/L PP-3-MCPD標準溶液0.100 mL，經(jīng)提取凈化后衍生化處理。每個添加平行測定3 次，結(jié)果如表2所示。

表 2 方法回收率與精密度Table 2 Recoveries and precision of the method

從表2可知，本方法3-MCPD的加標回收率在95.0%～115.0%之間，相對標準偏差為2.9%～6%。

2.3 菜肴中3-MCPD和3-MCPD酯含量結(jié)果

由表3可知，食堂菜肴中3-MCPD酯含量在43.56～178.8 μg/kg之間，3-MCPD含量在3.48～30.51 μg/kg之間。3-MCPD酯含量遠高于3-MCPD，二者的比值在3.34～20.61之間。由表4可知，餐館菜肴中3-MCPD酯含量在9.87～2 162.19 μg/kg之間，3-MCPD含量在3.69～40.24 μg/kg之間，3-MCPD酯與3-MCPD含量比值在2.67～73.52之間。在所有菜肴中均檢出3-MCPD酯和3-MCPD，可以看出它們在菜肴中的存在具有普遍性。而3-MCPD酯與3-MCPD含量比值遠大于1，說明3-MCPD酯較3-MCPD為更常見的一種存在形式。

表 3 食堂菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯分析結(jié)果Table 3 Contents of 3-MCPD and its esters in school canteen dishes

表 4 餐館菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯分析結(jié)果Table 4 Contents of 3-MCPD and its esters in restaurant dishes

食堂菜肴中的3-MCPD酯和3-MCPD含量普遍低于餐館菜肴。值得注意的是餐館菜肴中燉菜中3-MCPD酯和3-MCPD的含量較低。這可能是因為燉菜中水分含量高，3-MCPD酯的含量變化與含水量直接相關(guān)，在100 ℃條件下，隨水含量的增多而增多，20%含水量時達到最大值，而后下降顯著[29]。在燉菜中，大白菜燉豆腐中3-MCPD酯和3-MCPD的含量最低，而杏鮑菇燉山雞和西紅柿燉牛腩中3-MCPD無明顯增加，但3-MCPD酯的含量明顯增多，尤其是西紅柿燉牛腩中3-MCPD酯含量達到123.12 μg/kg，這可能是不同食材對3-MCPD酯含量的影響不同。Yu等[30]對不同雞胸肉油炸后對煎炸油進行研究，結(jié)果表明在160 ℃時，3-MCPD酯含量隨油炸時間延長而增加，然而對油炸土豆中的煎炸油進行分析卻得到了相反的結(jié)果，3-MCPD酯隨油炸時間延長呈現(xiàn)下降趨勢[31]，說明3-MCPD酯的分解量多于形成量。因此不同基質(zhì)對3-MCPD酯形成的影響可能不同。燒制烹調(diào)先以食用油為導熱媒介，后以水為傳熱介質(zhì)實現(xiàn)加工目的，所以燒制的菜肴的溫度較油炸、干鍋等低，造成3-MCPD酯含量較低。周紅茹[32]對不同溫度條件下3-MCPD酯含量進行分析，結(jié)果表明加熱到1 h時200 ℃條件下的生成量大于100 ℃，說明3-MCPD酯在高溫下生成速率小于分解速率。

在餐館菜肴中，油炸制法的菜肴中3-MCPD酯含量最高，而3-MCPD含量也較高，這可能是因為油炸中油脂含量高有關(guān)。很多研究者都認為在高含量3-MCPD酯存在與食品中的高油脂含量相關(guān)，如Markus等[33]用GC-MS檢測食品中氯丙醇酯含量，其中含量最高為人造黃油樣品；Becalski等[22]對加拿大市場中的食品進行了氯丙醇酯含量的檢測，同樣發(fā)現(xiàn)核桃、米糠、葡萄籽油和棕櫚油中的含量較高。

干鍋菜肴中3-MCPD酯與3-MCPD含量也普遍較高，這可能與加熱時間長有關(guān)，而炒菜雖然加工溫度比較高，但烹調(diào)時間短，所以3-MCPD和3-MCPD酯生成的量相對比較少。因此烹飪加熱時間對3-MCPD酯的形成也有重要的影響。這與相關(guān)文獻報道一致。Li Chang等[14]對油脂在精煉過程中的形成進行分析，3-MCPD酯在脫臭溫度（220～260 ℃）隨加熱時間延長而增高，1.0～1.5 h達到峰值后降低。

如圖3所示，3-MCPD酯和3-MCPD在不同烹飪方式中的變化規(guī)律：5 種烹飪工藝制成的菜肴中3-MCPD與3-MCPD酯差異規(guī)律相同；不同傳熱介質(zhì)烹調(diào)而成的菜肴中3-MCPD酯和3-MCPD含量由高到低依次為炸＞干鍋＞炒＞燒＞燉。

圖 3 不同烹飪方式餐館菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯的平均含量Fig. 3 Average contents of 3-MCPD and its esters in dishes produced by different cooking processes

根據(jù)《中國居民膳食指南2016》[34]要求，蔬菜推薦每日食用量為300～500 g，動物類每日食用量為120～200 g，中國居民的每日平均食用量為560 g。3-MCPD酯及3-MCPD含量按所有菜肴的平均值計算，食堂菜肴中的平均含量分別為75.86 μg/kg和10.43 μg/kg，餐館中的平均含量分別為516.11 μg/kg和17.88 μg/kg。若成人按65 kg體質(zhì)量計算，并假設3-MCPD酯可100%的轉(zhuǎn)化為3-MCPD，那么食堂菜肴中3-MCPD酯及3-MCPD的攝入量約為每天0.65 μg/kg和0.09 μg/kg。餐館菜肴中3-MCPD酯及3-MCPD的每天攝入量約為4.45 μg/kg和0.15 μg/kg。食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint Expert Committee on Food Additive，JECFA）提出3-MCPD的PMTDI為2 μg/（kg·d）。根據(jù)標準餐館菜肴中3-MCPD酯超出JECFA推薦的PMTDI值，為該標準的2.2 倍。一些研究者也對不同種類食品中3-MCPD酯的暴露量進行評估，里南[25]對油炸食品進行了暴露量分析，以污染水平的97.5%分位數(shù)計，3-MCPD酯的暴露量分別為3.04 μg/kg和6.08 μg/kg，為安全計量的1.52 倍和3.04 倍。Spungen等[35]對嬰兒配方奶粉中3-MCPD酯的暴露量進行評估，結(jié)果為7～10 μg/kg。Wei?haar[20]對超過200 種精煉油脂的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明3-MCPD酯的暴露量為1.5 μg/kg（占75%），說明很可能有部分人群已經(jīng)超標。以上結(jié)果表明，部分食品按3-MCPD的標準評估3-MCPD酯已超PMTDI值。

3 結(jié) 論

在所有檢測菜肴中均檢出3-MCPD酯和3-MCPD，可以看出其在菜肴中的存在具有普遍性。食堂菜肴中3-MCPD酯含量在43.56～178.8 μg/kg之間，3-MCPD含量在3.48～30.51 μg/kg之間。3-MCPD酯含量遠高于3-MCPD，二者的比值在3.34～20.61之間。餐館中3-MCPD酯含量在9.87～2 162.19 μg/kg之間，3-MCPD含量在3.69～40.24 μg/kg之間，3-MCPD酯與3-MCPD含量比值在2.67～73.52之間。不同的烹飪方式產(chǎn)生3-MCPD酯和3-MCPD的量不同，含量由高到低依次為炸＞干鍋＞炒＞燒＞燉。根據(jù)3-MCPD酯和3-MCPD暴露量計算結(jié)果，食堂菜肴中3-MCPD酯和3-MCPD的攝入量低于JECFA推薦的PMTDI值，而餐館菜肴中3-MCPD酯的攝入量高于JECFA推薦PMTDI值的2.2 倍，3-MCPD并未超標。目前在短時間加熱過程中3-MCPD酯與3-MCPD含量變化規(guī)律的研究不足，所以對于炒菜中各影響因素的研究仍有待進行。