固相萃取—微波衍生化—GC-MS法同時(shí)測(cè)定水中6種雌激素物質(zhì)

袁宏宇，王欣澤，，沈 劍，遲莉娜，字建婷，王榮會(huì)

（1. 上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201100；2. 上海交通大學(xué) 云南（大理）研究院，云南 大理 671000）

環(huán)境雌激素（Environmental estrogens，EEs）是屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的一類化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)入生物體會(huì)破壞機(jī)體穩(wěn)定性和正常調(diào)控作用［1］，包括天然內(nèi)源雌激素和人工合成外源雌激素兩大類。天然內(nèi)源雌激素通過(guò)動(dòng)物及人體排泄物釋放到環(huán)境中，包括雌酮（E1）、17β-雌二醇（β-E2）、17α-雌二醇（α-E2）、雌三醇（E3）［2］等?；瘜W(xué)工業(yè)技術(shù)的飛速發(fā)展導(dǎo)致大量合成有機(jī)化學(xué)品釋放到環(huán)境中，其中17α-乙炔基雌二醇（EE2）、雙酚A（BPA）是具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的典型雌激素類物質(zhì)［3-5］。大量研究表明，雌激素類物質(zhì)在濃度極低（ng/L級(jí)別）情況下就能對(duì)生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)等造成損傷，且雙酚A、EE2與天然雌激素之間可能還會(huì)存在協(xié)同效應(yīng)［6-7］。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS）因其分離效果好、靈敏度高及成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)成為目前最為常用的EEs分析測(cè)定方法［8-10］，由于EEs具有痕量特征，通常需要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、富集及濃縮等復(fù)雜前處理步驟，從而給分析測(cè)定帶來(lái)了極大困難。目前常用的前處理方法包括固相萃?。⊿PE）［11-12］、液液萃?。↙LE）［13-14］、固相微萃?。⊿PME）［15］等，其中固相萃取因其簡(jiǎn)便高效等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。

本工作系統(tǒng)優(yōu)化了氣相色譜柱升溫程序、衍生化條件以及固相萃取小柱類型，建立了快速同時(shí)測(cè)定水中這6種雌激素物質(zhì)的分析方法，對(duì)研究水體環(huán)境雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)具有重要應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和設(shè)備

TRACE1300型GC，ISQ Series Quadrupole 型MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)ThermoFisher公司；TriPlus RSH型自動(dòng)進(jìn)樣器：美國(guó)ThermoFisher公司；SQP型電子天平：德國(guó)賽多利斯公司；SBAB-57044型CNW 12位固相萃取裝置：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；HC-C18型、Poly-Sery HLB型、Poly-Sery PSD型、ENVI-18 SPE型等4種萃取小柱：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

雌激素分析標(biāo)準(zhǔn)物（E1、17α-E2、17β-E2、E3、EE2、BPA）、標(biāo)準(zhǔn)替代物（17β-E2-2，4-d2）以及內(nèi)標(biāo)物（滅蟻靈）：均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；含有1% （w，下同）三甲基氯硅烷（TMCS）的雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：購(gòu)自上海麥克林公司。

甲醇：色譜級(jí)，純度≥99.9%；乙酸乙酯：HPLC級(jí)，純度≥98.0%；正己烷：HPLC級(jí)，純度≥98.0%；無(wú)水吡啶溶液：純度≥99.8%。

精確稱量6種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品以及標(biāo)準(zhǔn)替代物各50 mg，分別溶于50 mL甲醇中，配制成1 g/L的高濃度單標(biāo)溶液，分別移取100 μL到10 mL容量瓶中，再加入甲醇配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱量50 mg 滅蟻靈溶于50 mL 正己烷中，配制成1 g/L 的高濃度內(nèi)標(biāo)溶液。配制好的溶液放置于-20 ℃冰箱中冷凍避光保存，根據(jù)需要逐級(jí)稀釋使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固相萃取

取200 μL各雌激素質(zhì)量濃度分別為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到1 L超純水中，配成雌激素質(zhì)量濃度分別為200 ng/L的水樣。選擇HC-C18、Poly-Sery HLB、Poly-Sery PSD以及ENVI-18等4種不同類型的萃取小柱對(duì)水樣進(jìn)行固相萃取，考察不同萃取小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的回收率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

固相萃取分為以下4個(gè)步驟：1）萃取小柱活化與平衡，先分別取5 mL乙酸乙酯與5 mL甲醇過(guò)柱，使萃取小柱活化，再用5 mL超純水清洗2次，流量約為2 mL/min；2）水樣過(guò)柱，用真空泵抽取過(guò)濾水樣通過(guò)萃取小柱，富集待測(cè)物于填料中；3）淋洗雜質(zhì)，用10 mL 10%（w）甲醇溶液洗滌小柱，抽真空30 min左右直至小柱表面干裂；4）洗脫目標(biāo)物，用10 mL乙酸乙酯洗脫萃取小柱中的待測(cè)物，控制流量為2 mL/min左右，并用試管收集洗脫液。

1.3.2 衍生化

將固相萃取洗脫液（衍生化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)以配制的雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液代替固相萃取洗脫液）在30 ℃條件下通入溫和高純氮?dú)猓稍锿耆蠹尤?5 μL（BSTFA+1% TMCS）+50 μL吡啶作為衍生化試劑，一定微波功率下加熱一定時(shí)間，再在30 ℃條件下用溫和氮?dú)飧稍?，加濃度? mg/L的內(nèi)標(biāo)物滅蟻靈溶液定容至400 μL，轉(zhuǎn)入2 mL進(jìn)樣瓶，待GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS

1）GC條件：TR5-MS型石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；99.999%高純氦氣為載氣，采用恒流模式（載氣流量1.2 mL/min）；不分流進(jìn)樣，每次取樣量為1.0 μL；隔墊吹掃5.0 mL/min。實(shí)驗(yàn)考察色譜柱升溫程序。

2）MS條件：電子轟擊離子源（EI），電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間10 min。采用全掃描模式進(jìn)行定性分析、離子掃描模式進(jìn)行定量測(cè)定，全掃描質(zhì)量數(shù)范圍（m/z）為33～650。使用Xcalibur軟件進(jìn)行定性分析，確定6種雌激素目標(biāo)物、標(biāo)準(zhǔn)替代物及內(nèi)標(biāo)物所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)譜圖以及保留時(shí)間，選擇3～4個(gè)相對(duì)豐度較強(qiáng)、分子量較大的碎片離子作為定性離子，并選擇其中豐度最強(qiáng)且與其他物質(zhì)特征離子沒(méi)有干擾的定性離子作為定量離子。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限及線性范圍的確定

用含有6種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成各物質(zhì)含量分別為1，3，5，10，25，50，100，200，300 ng的梯度濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入物質(zhì)含量為100 ng的17β-E2-2，4-d2（標(biāo)準(zhǔn)替代物）溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行固相萃取—微波衍生化—GC-MS分析測(cè)定，以各目標(biāo)物的定量離子峰與內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，以各目標(biāo)物質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。以信噪比S/N =3結(jié)合目標(biāo)物回收率計(jì)算分析方法的檢出限（LOD），以信噪比S/N=10計(jì)算該方法的定量限（LOQ）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱升溫程序的選擇

氣相柱溫箱的升溫程序影響著目標(biāo)物的保留時(shí)間、峰分離度以及峰形等，對(duì)定性與定量分析均會(huì)產(chǎn)生一定的影響。設(shè)置3種不同的升溫程序（見(jiàn)表1），考察全掃描色譜圖出峰效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，程序升溫方式2條件下雌激素物質(zhì)的全掃描總離子色譜譜圖中6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物均出峰、峰形良好且分離度較好，見(jiàn)圖1。因此確定柱溫箱最佳升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持2 min；以20 ℃/min的升溫速率上升至260 ℃，保持5 min；再以3 ℃/min的升溫速率上升至280 ℃，保持5 min。在此升溫程序條件下，總掃描時(shí)長(zhǎng)為24.62 min。

表1 3種程序升溫方式

圖1 程序升溫方式2條件下6種雌激素物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物的全掃描總離子色譜譜圖

2.2 色譜與質(zhì)譜特征

根據(jù)圖1數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，得到每種雌激素物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及特征離子，見(jiàn)表2。

2.3 衍生化條件優(yōu)化

由于雌激素類物質(zhì)為弱極性至中等極性化學(xué)物，毛細(xì)管色譜柱為非極性柱，目標(biāo)物質(zhì)直接進(jìn)樣的出峰效果差，且會(huì)對(duì)色譜柱造成損害，故采用BSTFA+1%TMCS+吡啶作為衍生化試劑。目標(biāo)物經(jīng)衍生化后，產(chǎn)物單一穩(wěn)定，分離效果好，靈敏度高［16-17］。

2.3.1 衍生化加熱方式的選擇

因可通過(guò)提高極性分子運(yùn)動(dòng)速度和碰撞頻率快速加熱物質(zhì)、快速提高物質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)速率，微波在樣品前處理中得到了廣泛應(yīng)用［18-21］。為了提高衍生化效率，本實(shí)驗(yàn)將微波加熱衍生化與水浴及烘箱加熱衍生化的效果進(jìn)行了對(duì)比研究。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：水浴及烘箱加熱衍生化的最佳條件為40 ℃反應(yīng)20 min，這與王園園等［22］的研究結(jié)果一致，加熱溫度過(guò)高可能會(huì)生成不利于GC-MS分析的副產(chǎn)物，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，對(duì)提高目標(biāo)物回收率貢獻(xiàn)不大。衍生化方式對(duì)雌激素物質(zhì)峰面積的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)：常溫20 ℃條件下峰面積最小，說(shuō)明衍生化效果最差；水浴40 ℃和烘箱40 ℃加熱條件下峰面積大致相當(dāng)；微波252W加熱3 min衍生化的各目標(biāo)物峰面積略低于水浴和烘箱加熱；微波567 W加熱3 min的衍生化效果最佳，各目標(biāo)物的峰面積相比常溫20℃衍生化增加了24.09%～42.97%，相比烘箱加熱衍生化增加了12.12%～24.31%，相比水浴加熱衍生化增加了8.06%～33.53%，相比微波252 W加熱3 min衍生化增加了16.62%～28.12%。微波加熱使衍生化時(shí)間大幅縮短至3 min，與傳統(tǒng)衍生化方式相比，衍生化效率顯著提升。

表2 雌激素物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及其特征離子

圖2 衍生化方式雌激素物質(zhì)的峰面積

2.3.2 微波衍生化條件

微波功率和加熱時(shí)間是影響微波衍生化效果的關(guān)鍵因素［23-24］。采用BSTFA +1%TMCS+吡啶作為衍生化試劑，分別考察不同微波功率和不同加熱時(shí)間對(duì)6種雌激素物質(zhì)衍生化效果的影響，每組實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3 次，計(jì)算平均峰面積。

2.3.2.1 微波功率

在微波加熱時(shí)間為3 min的條件下，微波功率對(duì)雌激素物質(zhì)峰面積的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)：252 W微波加熱功率下，雌激素物質(zhì)峰面積均較小，說(shuō)明衍生化反應(yīng)不完全導(dǎo)致衍生化效果差；微波功率升高至315 W時(shí)，雌激素物質(zhì)峰面積均達(dá)到最大，說(shuō)明衍生化效率達(dá)到最佳；微波功率調(diào)至406 W時(shí)雌激素物質(zhì)峰面積明顯減小，再繼續(xù)提高微波功率也無(wú)明顯變化，說(shuō)明微波功率過(guò)高時(shí)部分衍生化產(chǎn)物可能發(fā)生分解或與衍生化試劑進(jìn)一步反應(yīng)生成了不利于GC-MS分析的副產(chǎn)物，導(dǎo)致雌激素物質(zhì)峰面積減小，衍生化效果變差。

圖3 微波功率對(duì)雌激素物質(zhì)峰面積的影響

2.3.2.2 微波加熱時(shí)間

在微波功率315 W條件下，微波加熱時(shí)間對(duì)雌激素物質(zhì)峰面積的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波加熱時(shí)間對(duì)雌激素物質(zhì)峰面積的影響

由圖4可見(jiàn)：隨著微波加熱時(shí)間增加，雌激素物質(zhì)峰面積逐漸增大；當(dāng)微波加熱時(shí)間為4 min時(shí)，6種雌激素物質(zhì)的峰面積均最大，衍生化效果最好；再增加微波加熱時(shí)間則衍生化效果無(wú)明顯變化。為了防止衍生化產(chǎn)物分解并保證最佳衍生化效率，所以選擇微波功率315 W條件下加熱4 min為最佳衍生化條件。

2.4 固相萃取條件優(yōu)化

4種不同類型萃取小柱吸附6種雌激素物質(zhì)的回收率見(jiàn)圖5。

圖5 4種不同類型萃取小柱吸附6種雌激素物質(zhì)的回收率

由圖5可見(jiàn)：HC-C18小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的回收率范圍為82.93%～115.00%，對(duì)6種雌激物質(zhì)吸附效果良好；Poly-Sery HLB小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的回收率范圍為50.95%～174.14%，回收率波動(dòng)范圍偏大，其中對(duì)E3和17β-E2吸附效果較差，回收率分別只有50.95%和60.51%；Poly-Sery PSD小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的回收率范圍為45.15%～93.10%，對(duì)E1和E3的回收率均高于90%，但對(duì)其余4種目標(biāo)物的回收效果相對(duì)較差，均低于70%；ENVI-18 SPE小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的回收率范圍為52.21%～90.18%，對(duì)E3和17α-E2吸附效果較好，其余目標(biāo)物則效果一般。綜上所述，HC-18小柱對(duì)6種雌激素物質(zhì)的吸附效果比其他3種小柱好，且吸附穩(wěn)定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限及線性范圍

6種雌激素物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及線性范圍見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，各目標(biāo)物峰面積與其質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.999；BPA、E1、EE2及E3的線性范圍為3～300 ng/L，17α-E2及17β-E2的線性范圍為5～300 ng/L；方法檢出限為2.0～5.0 ng/L。

表3 6種雌激素物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及線性范圍

2.6 方法加標(biāo)回收率及精密度

6種雌激素物質(zhì)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，3種加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率范圍為76.45%～96.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為3.2%～9.8%（n=3）。表明本方法的回收率較高，精密度良好。

表4 6種雌激素物質(zhì)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

2.7 與其他方法的比較

本方法與其他方法的對(duì)比見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)：本方法可以同時(shí)測(cè)定6種雌激素物質(zhì)，分析物數(shù)量比其他3種方法更多；采用微波加熱將衍生化時(shí)長(zhǎng)縮短至4 min，相比其他方法，衍生化效率顯著提升；同時(shí)還能保證方法檢出限滿足水樣測(cè)定要求。綜上，本方法靈敏快捷、簡(jiǎn)便高效，適用于大批量水樣雌激素的分析測(cè)定。

表5 本方法與其他方法的對(duì)比

2.8 實(shí)際水樣分析

采用建立的分析方法測(cè)定了云南大理洱海流域3處地表水樣，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)：除17β-E2外，其余5種雌激素物質(zhì)均被檢出，濃度范圍為7.24～128.64 ng/L；其中17α-E2的流域濃度最低，為7.24～10.88 ng/L；3處水樣中，水樣#285的E1濃度顯著高于其他兩處水樣，達(dá)到128.64 ng/L。

表6 實(shí)際水樣的分析結(jié)果 ρ，ng/L

3 結(jié)論

a） 通過(guò)對(duì)氣相色譜柱升溫程序、前處理步驟中的固相萃取及衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了可快速同時(shí)測(cè)定天然雌激素物質(zhì)雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇以及人工合成雌激素17α-乙炔基雌二醇、雙酚A等6種雌激素物質(zhì)的固相萃取—微波衍生化—GC-MS分析方法。

b）色譜柱最佳升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持2 min；以20 ℃/min速率升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min速率升至280 ℃，保持5 min。6種雌激素物質(zhì)的全掃描色譜圖的出峰效果良好，且分離度高。

c）最佳衍生化條件為：在試樣中添加BSTFA+1%TMCS+吡啶作為衍生化試劑，315 W微波加熱4 min。相比烘箱、水浴等傳統(tǒng)衍生化加熱方式，微波加熱時(shí)間縮短至4 min，衍生化效率提升明顯。

d）最佳固相萃取小柱類型為HC-C18小柱，回收率范圍為82.93%～115.00%。本方法對(duì)BPA、E1、EE2及E3的線性范圍為3～300 ng/L；17α-E2及17β-E2的線性范圍為5～300 ng/L；方法檢出限為2.0～5.0 ng/L，加標(biāo)回收率為76.45%～96.24%。