正交試驗(yàn)法優(yōu)化紅掌‘阿拉巴馬’葉片的組織培養(yǎng)體系

向 丹，喻 娜，趙 靜，崔 帥

（廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川廣安 638019）

紅掌（Anthurium andraeanum），又名大葉花燭、安祖花、幸運(yùn)花等，是天南星科花燭屬的多年生常綠草本植物。紅掌花朵為佛焰苞，色澤艷麗，花色多且花期長，葉柄長，葉形獨(dú)特而具光澤，是觀花觀葉皆宜的世界名貴花卉之一。在國內(nèi)，紅掌已經(jīng)成為極具觀賞性和商業(yè)開發(fā)價(jià)值的高檔切花和盆栽花卉種類[1]，市場需求量大，培育技術(shù)應(yīng)用價(jià)值高。

紅掌傳統(tǒng)的繁殖方式為種子繁殖和分株繁殖[2]，傳統(tǒng)方法繁殖速度慢，已經(jīng)不能滿足市場對紅掌的需求。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有保留親本優(yōu)良性狀、繁殖速度快的優(yōu)點(diǎn)，已在植物育種方面廣泛運(yùn)用，也已經(jīng)成為紅掌快繁的主要途徑[3]。目前，國內(nèi)有關(guān)紅掌組培的研究報(bào)道較多，但是在許多報(bào)道中未明確紅掌的品種，而不同紅掌品種、不同外植體部位等需要的組織培養(yǎng)條件是相差很大的，從而導(dǎo)致紅掌組培仍然存在許多問題，如不同研究中紅掌的組培方法差異大，甚至存在相反的結(jié)果[4]，組培方法的重現(xiàn)性差[5]，愈傷組織誘導(dǎo)和不定分化是影響紅掌組培快繁的主要因素。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種研究多因素多水平的試驗(yàn)方法，可以在多個(gè)影響因素中選出代表性強(qiáng)的試驗(yàn)組合，優(yōu)化試驗(yàn)方案，比單純的觀察和測量更加精確和更具說服力。以紅掌品種阿拉巴馬的葉片為材料[6]，對紅掌愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化條件的培養(yǎng)基種類、激素種類和濃度、活性炭濃度進(jìn)行優(yōu)化，旨在通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找紅掌阿拉巴馬葉片組織培養(yǎng)過程中愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的最優(yōu)培養(yǎng)基組合，以優(yōu)化紅掌的組培快繁技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從廣安市花卉市場購買紅掌阿拉巴馬植株，選取生長健壯植株的幼嫩葉片作為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，再選取愈傷組織開展不定芽誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。

1.2 外植體的選取與消毒

從生長健壯的植株上剪下展葉約2 周的幼嫩葉片，用洗潔精洗凈葉片表面，在流水下沖洗30min，吸水紙吸干葉片表面水分，用0.1%的HgCl2消毒5min，無菌水沖洗5 次，置于超凈臺盛有無菌水的無菌瓶中備用。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

在超凈工作臺內(nèi)切去外植體與藥液接觸的傷口，用解剖刀把葉片切成1cm×1cm 大小，接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)因子、3 個(gè)水平（表1），每瓶接種3 個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20 瓶，3 次重復(fù)。50d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)L9（34）因素和水平

1.4 不定芽的分化

待誘導(dǎo)出的愈傷組織生長至直徑約為1.0～1.5cm時(shí)，將其切下接種至誘導(dǎo)不定芽分化的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。不定芽分化培養(yǎng)基采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)因子，3 個(gè)水平（表2），每瓶接種3 個(gè)不定芽，每個(gè)處理接種10 瓶，3 次重復(fù)。在繼代培養(yǎng)60d 后，統(tǒng)計(jì)不定芽分化的情況。

表2 不定芽分化誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)L9（34）因素和水平

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基pH 值為5.8，瓊脂為6g/L，蔗糖為3%。不定芽分化誘導(dǎo)均以MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。接種后的培養(yǎng)瓶置于組培室內(nèi)，溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1500Lx，光照時(shí)間為12h/d。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Excel 軟件上處理后，再用SPSS 軟件進(jìn)行分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)目/接種的外植體數(shù)目×100；不定芽分化率（%）=分化不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅掌愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)基種類對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。以1/2MS、MS 和N6 培養(yǎng)基對紅掌葉片進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果表明，3 種培養(yǎng)基作用存在顯著差異（p＜0.05），誘導(dǎo)效果依次為1/2MS＞MS＞N6（表3、表4），由此可知，以1/2MS 作為培養(yǎng)基進(jìn)行紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)的效果較好。

2.1.2 6-BA 對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。6-BA濃度對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響效果表現(xiàn)為2.0 mg/L＞1.0mg/L＞3.0mg/L（表3、表4），說明6-BA在培養(yǎng)基中的濃度以2.0mg/L 為佳，濃度過低不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，濃度高于2.0mg/L 會使愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，6-BA 對紅掌葉片愈傷組織的誘導(dǎo)作用存在顯著差異（p＜0.05）。

2.1.3 2,4-D 對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。2,4-D濃度對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響效果表現(xiàn)為0.6mg/L＞0.2mg/L＞1.0mg/L（表3、表4），說明2,4-D在培養(yǎng)基中的濃度以0.6mg/L 為佳，低濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)效果不明顯，濃度高于0.6mg/L 會使愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，2,4-D 對紅掌葉片愈傷組織的誘導(dǎo)作用存在顯著差異（p＜0.05）。

由極差分析可知（表3），培養(yǎng)基種類、6-BA 濃度、2,4-D 濃度3 個(gè)因素的極差值大小分別為培養(yǎng)基＞6-BA＞2,4-D，表明培養(yǎng)種類是對愈傷組織誘導(dǎo)影響最大的因素，2,4-D 濃度是對愈傷組織誘導(dǎo)影響最小的因素，這3 個(gè)因素對愈傷組織誘導(dǎo)率影響的順序依次為培養(yǎng)基種類＞6-BA 濃度＞2,4-D 濃度。而且，A因素在第1 水平的k 值大于第2、3 水平的k 值，B、C 2個(gè)因素在第2 水平對應(yīng)的k 值均大于第1、3 水平的k值。由此確定愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A1B2C2，即1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L 2,4-D。依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，配制最優(yōu)組合培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，紅掌阿拉巴馬葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率為88%，說明正交試驗(yàn)結(jié)果較好，該培養(yǎng)基組合為最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表3 愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和極差分析

表4 愈傷組織誘導(dǎo)率方差分析

2.2 紅掌不定芽分化條件的優(yōu)化

2.2.1 6-BA 對紅掌不定芽分化率的影響。不同用量的IBA 對紅掌不定芽的誘導(dǎo)作用存在顯著差異（p＜0.05），誘導(dǎo)效果依次為1.5mg/L 6-BA ＞2.5mg/L 6-BA＞0.5mg/L 6-BA（表5、表6），表明IBA 在濃度為1.5mg/L 時(shí)對不定芽的誘導(dǎo)效果最佳，濃度過低不利于不定芽的誘導(dǎo)分化，高于1.5mg/L 會降低不定芽的分化率。

2.2.2 IBA 對紅掌不定芽分化率的影響。IBA 濃度對紅掌不定芽誘導(dǎo)率的影響效果表現(xiàn)為0.2mg/L＞1.0mg/L＞0.6mg/L（表5、表6），說明IBA 在培養(yǎng)基中的濃度以0.2mg/L 為佳，IBA 對紅掌不定芽的誘導(dǎo)作用存在顯著差異（p＜0.05）。

2.2.3 活性炭對紅掌不定芽分化率的影響。活性炭濃度對紅掌不定芽誘導(dǎo)率的影響效果表現(xiàn)為1.0g/L＞5.0g/L＞3.0g/L（表5、表6），說明活性炭在培養(yǎng)基中的濃度以1.0g/L 為佳，濃度升高會使不定芽的分化率下降，活性炭對紅掌不定芽的誘導(dǎo)作用存在顯著差異（p＜0.05）。

由極差分析可知（表5），6-BA、IBA、活性炭3 個(gè)因素的極差值大小分別為Y＞X＞Z，表明IBA 是對紅掌不定芽誘導(dǎo)影響最大的因素，活性炭濃度是對紅掌不定芽誘導(dǎo)影響最小的因素，即這3 個(gè)因素對紅掌不定芽分化率影響的順序依次為IBA 濃度＞6-BA 濃度＞活性炭濃度。X 因素在第2 水平的k 值大于第1、3 水平的k 值，Y 因素在第1 水平的k 值大于第2、3 水平的k 值，Z 因素在第1 水平對應(yīng)的k 值大于第2、3水平的k 值，因此，結(jié)合各因素極差大小，紅掌不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為Y1X2Z1，即MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+1.0g/L 活性炭。依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，配制最優(yōu)組合培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到紅掌阿拉巴馬葉片的不定芽誘導(dǎo)率為91%，說明正交試驗(yàn)結(jié)果較好，該培養(yǎng)基組合為最優(yōu)不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表5 不定芽分化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和極差分析

表6 不定芽分化率的方差分析

3 結(jié)論與討論

正交試驗(yàn)在植物組織培養(yǎng)的研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[7]，該試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)探討了不同培養(yǎng)基、激素和活性炭對紅掌阿拉巴馬葉片組織培養(yǎng)的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基種類、激素種類和濃度對紅掌愈傷組織的誘導(dǎo)有重要的影響，其中以培養(yǎng)基種類的影響最顯著，說明培養(yǎng)基成分是影響紅掌愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素，這與林茂等[5]研究報(bào)道結(jié)果一致。1/2MS 基本培養(yǎng)基滿足了紅掌葉片最基本的生理活動(dòng)，還需要搭配合適的植物激素以滿足愈傷組織的形成和增殖。6-BA是植物組織培養(yǎng)過程中常用的細(xì)胞分裂素[8]，2,4-D 是對愈傷組織誘導(dǎo)形成效果較好的生長素[9]。正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素作用效果依次為培養(yǎng)基種類＞6-BA濃度＞2,4-D濃度，培養(yǎng)基組合為1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L 2,4-D。

在愈傷組織形成之后2,4-D 對不定芽的生長有抑制作用，因此在誘導(dǎo)不定芽分化時(shí)選用IBA 作為生長素[10]。紅掌次生代謝會產(chǎn)生較多酚類物質(zhì)，容易引起組培過程中外植體發(fā)生褐化，影響不定芽的分化，活性炭是良好的吸附劑，可以有效抑制外植體褐化病提高不定芽的分化率。正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，影響不定芽分化因素的作用效果依次為IBA＞6-BA＞活性炭，培養(yǎng)基組合為MS+1.5mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA+1.0g/L 活性炭。

在后續(xù)的研究中可將外植體部位也作為一個(gè)試驗(yàn)因素，探尋紅掌阿拉巴馬組培的最適外植體部位，進(jìn)一步探討各因素之間的交互作用，精確各因素用量的最佳組合，并將這種研究思路推廣至其它紅掌品種，為實(shí)現(xiàn)紅掌組培快繁的標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模繁殖提供理論依據(jù)。