刺五加組織培養(yǎng)快繁技術研究

劉國麗,龔 娜,楊 光

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院，沈陽 110866）

刺 五 加[Acanthopanax senticosus（Rupr.rt Maxim.）Harms]屬于五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax），又稱五加參、老虎鐐子、刺拐棒[1]。主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、陜西等省及俄羅斯、朝鮮、韓國、日本諸國[2]。作為一種新型水果，刺五加果實富含多種活性物質(zhì)，具有抗疲勞、改善睡眠等功效[3～5]，為珍稀保健食品，具有較好的經(jīng)濟價值和藥用價值。現(xiàn)已利用刺五加漿果開發(fā)出風味獨特、具有保健功能的刺五加果酒、果醋、果汁飲料、果糕等食品。

隨著刺五加相關商品不斷被開發(fā)，人們對刺五加的需求量日益增加，對野生刺五加采挖強度不斷加大，甚至挖斷野生刺五加根系。這種無限制地自由采挖，加上刺五加自身繁殖能力低，導致刺五加野生資源的嚴重破壞，產(chǎn)量大幅削減[6]。因此，探索刺五加種苗繁育技術，提高刺五加栽培水平，加大人工保護和培育是實現(xiàn)刺五加產(chǎn)業(yè)可持續(xù)利用的必然之路。本研究以刺五加的分蘗芽為外植體，開展不同消毒方法及不同激素濃度組合對芽誘導和增殖影響的研究，以期為刺五加快繁體系的建立和開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年在遼寧省農(nóng)科院省重點實驗室進行。供試材料為野生、健壯、無病蟲害且?guī)в型暾枬M越冬芽的刺五加根頸。洗凈根部的泥土，將枝條切割成2～3 cm 的小段，置于飽和洗衣粉溶液浸泡10 min，流水沖洗2～3 h，再用無菌水沖洗3 遍，置于超凈臺備用。

1.2 試驗設計

1.2.1 外植體消毒時間試驗

選取刺五加的分蘗芽作為外植體，以75%乙醇浸泡消毒30 s，無菌水沖洗3 遍，再用0.1%升汞分別消毒處理3、5、7、10 min；消毒后用無菌水沖洗5 次，吸干表面的水分；用無菌手術刀剝?nèi)パ勘Ｗo層，接種于培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。設置溫度為22 ℃，光照強度為1 500 lx，光照時間為12 h/d。每個處理接種10 瓶，每瓶3 個外植體。定期觀察統(tǒng)計外植體污染率、存活率、死亡率、萌發(fā)及生長狀況。

死亡率（%）=（接種的外植體總數(shù)-污染的外植體數(shù)-存活的外植體數(shù)）/接種的外植體總數(shù)×100

1.2.2 芽誘導培養(yǎng)的激素組合篩選試驗

MS 培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA 和NAA（表1），接入外植體，對其進行不定芽誘導。每個培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶接2 個外植體，重復3 次。定期觀察不同激素濃度組合因素對芽形成的影響。

誘導率（%）=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/存活的外植體數(shù)×100

表1 芽誘導培養(yǎng)基不同激素濃度組合

1.2.3 增殖培養(yǎng)的激素組合篩選試驗

采用MS 培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA 和IBA（表2），接入誘導出的叢生芽。每個處理10 瓶，每瓶2 個外植體，重復3 次。

增殖倍數(shù)=萌發(fā)出叢生芽的總數(shù)/（接種的外植體總數(shù)-污染的外植體數(shù)）

表2 外植體繼代增殖培養(yǎng)基不同激素濃度組合

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)計算在Microsoft Excel 2007 中進行，方差分析采用Duncan's 新復極差檢驗法進行數(shù)據(jù)方差分析，在SPSS19.0 中完成。

2 結果與分析

2.1 刺五加外植體消毒的最佳時間

外植體的消毒處理非常重要，直接決定組織培養(yǎng)的成功與否[7]。外植體上附著各種雜菌，若消毒時間過短，外植體雜菌未被完全殺死，污染率高，外植體存活率低；消毒時間過長，外植體受到傷害嚴重，難以萌發(fā)。接種35 d 后，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計（表3），不同升汞消毒時間對刺五加外植體污染率、存活率及死亡率的影響顯著。隨著消毒時間的延長，污染率逐漸降低，死亡率升高。升汞消毒7 min 消毒效果較好，污染率較低（11.11%），存活率最高（81.11%）；升汞消毒10 min 外植體雖然污染率最低（3.33%），但是芽褐變嚴重，芽的存活率比消毒7 min 低。

表3 不同消毒方法對刺五加外植體的影響

2.2 刺五加芽誘導培養(yǎng)的適宜激素組合

激素具有調(diào)節(jié)植物生長和刺激細胞分裂作用，添加激素種類和濃度是芽誘導和增殖的關鍵影響因素。接種35 d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計（表4），6-BA和NAA不同濃度組合對刺五加芽誘導率影響顯著。6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1組合處理的芽誘導率最高 （85.56%）。其 次 為6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1處 理 的（82.22%）。此外，當NAA 濃度一定時，6-BA 濃度與芽誘導率有一定正相關。當6-BA 濃度為0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1時，NAA 濃度增加芽誘導率也隨之增加；當6-BA 濃度為1.5 mg·L-1時，NAA 濃度為0.8 mg·L-1的芽誘導率低于NAA 0.5 mg·L-1和0.3 mg·L-1處理的。

表4 不同激素濃度組合對刺五加外植體芽誘導率的影響

2.3 刺五加增殖培養(yǎng)的適宜激素組合

把誘導出的叢生芽轉入增殖培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)。由表5可見，不同濃度激素組合對外植體繼代增殖的影響很大。其中MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，增殖倍數(shù)最大（3.4 倍），且苗葉片大，生長健壯。其次為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.25 mg·L-1，增殖倍數(shù)次之（3.13 倍）。此外，當6-BA 濃度一定時，IBA 濃度增加，增殖倍數(shù)也隨之增大。

表5 不同激素組合對外植體繼代增殖的影響

3 結論

外植體木質(zhì)化程度不同、攜帶雜菌等都會影響消毒的效果，因此合適的外植體與最佳消毒方法非常重要，是組織培養(yǎng)成功的關鍵。本研究以刺五加的分蘗芽為外植體，用75%乙醇消毒30 s 后，采用0.1%升汞消毒7 min 的，外植體污染率低，存活率高（ 81.11%）。刺五加芽誘導培養(yǎng)的最佳激素組合為6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，芽誘導率最高（85.56%）；增值培養(yǎng)的最佳激素組合為6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，芽增殖倍數(shù)最高（3.4 倍），叢生芽生長勢好，健壯。