伊藤雜種‘巴茨拉’不同外植體無(wú)菌體系建立及愈傷組織誘導(dǎo)

孫茂桐，李際紅，任 靜，秦永健，盧 潔，孟凡志*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018； 2.山東省林業(yè)保護(hù)和發(fā)展服務(wù)中心，山東 濟(jì)南 250014)

‘巴茨拉’(Paeonia (Itoh Group) ‘Bartzella’)屬于芍藥組(Paeonia Sect.Paeonia)與牡丹組(Paeonia Sect.Moutan) 植物雜交所培育出的一類組間遠(yuǎn)緣雜交種， 又稱伊藤雜種 (Paeonia Itoh)[1]。 ‘巴茨拉’ 兼具芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的生長(zhǎng)特性和牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的花形特征，有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，具有花大而艷麗，株型飽滿，抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。 另外，‘巴茨拉’具有罕見(jiàn)的黃色花色，是公認(rèn)最美的伊藤雜種，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。

由于‘巴茨拉’主要依靠嫁接和分株的方式進(jìn)行繁殖，導(dǎo)致其繁殖系數(shù)較低和培育周期較長(zhǎng)[4]，而組織培養(yǎng)作為一種高效的無(wú)性繁殖方式是實(shí)現(xiàn)‘巴茨拉’產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的理想手段。 目前對(duì)‘巴茨拉’再生體系的研究主要集中在叢生芽誘導(dǎo)方面[5]，而對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)方面研究較少。 愈傷組織具有較高的再生能力，可被誘導(dǎo)直接分化或先誘導(dǎo)體胚再分化成苗，是進(jìn)行再生體系研究的良好材料[6]。 因此探索高效穩(wěn)定的愈傷組織誘導(dǎo)方法對(duì)推動(dòng)‘巴茨拉’組培快繁及離體再生研究具有一定的理論和實(shí)踐意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)‘巴茨拉’同屬的芍藥和牡丹愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行了大量研究。 劉蓉等[7]以‘鳳丹’幼胚作為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，并證明H2O2對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用。蒲艷[8]以‘滇牡丹’葉柄作為外植體篩選出2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA 的激素組合對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳。 劉廣甫[9]以芍藥品種‘粉玉奴’莖段為材料進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著影響，紅光對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)最有利。

然而目前伊藤雜種在這方面的研究較少，且由于其芽生于地下的生長(zhǎng)習(xí)性[10]和酚類物質(zhì)含量高的生理特點(diǎn)[7]在無(wú)菌體系建立階段具有諸多困難。 因此本研究以鱗芽、莖段、葉柄、嫩葉作為外植體探究‘巴茨拉’的無(wú)菌體系建立及愈傷組織誘導(dǎo)方法。 為后續(xù)‘巴茨拉’的組培快繁提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2020年12月從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站大田挖出‘巴茨拉’帶有鱗芽的根莖，一部分鱗芽被立即切下作為外植體；另一部分被埋藏在基質(zhì)中，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暗培養(yǎng)，待抽生黃化嫩枝后取嫩葉、葉柄、莖段3 部分與鱗芽一起作為實(shí)驗(yàn)中的四類外植體(圖1)。

圖1 莖段、嫩葉、葉柄、鱗芽外植體（圖中比例尺為2 cm）Figure 1 Stem segment, young leaves, petiole and scale bud explants

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 升汞不同處理時(shí)間對(duì)外植體的滅菌效果

使用洗滌劑清洗四種外植體表面， 后在流水下沖洗1 h， 置于超凈工作臺(tái)中使用酒精處理20 s， 再在0.1%的升汞中浸泡滅菌，為了對(duì)比不同升汞(0.1%)處理時(shí)間的滅菌效果，設(shè)置3 min、5 min、8 min、12 min 4 個(gè)處理時(shí)間，最后使用無(wú)菌水沖洗3～4 次后接種到不含激素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d 后統(tǒng)計(jì)不同外植體的污染率及存活率。

1.2.2 褐化抑制劑對(duì)不同外植體褐化率及存活率的影響

為探究褐化抑制劑種類及濃度對(duì)莖段、葉柄、葉片3 種外植體褐化率的影響，選擇AC(活性炭)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc(抗壞血酸)3 種褐化抑制劑并分別設(shè)置3 種不同濃度，AC(0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L)、Vc(0 mg/L、5、10 mg/L)、PVP(0 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L)，使用L9(33)正交表安排共9 種處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每次重復(fù)接種嫩葉、葉柄、莖段各20～25 個(gè)，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)褐化率及存活率。

1.2.3 激素對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為探究激素種類及濃度對(duì)莖段、葉柄、嫩葉3 種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量的影響，將3 種外植體分別接種到添加2,4-D 或6-BA 的培養(yǎng)基中，兩種激素各設(shè)置3 個(gè)濃度2,4-D(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)、6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共計(jì)6 種處理，每個(gè)處理重復(fù)接種3 次，每個(gè)重復(fù)接種20～25 個(gè)外植體。 培養(yǎng)4 周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并調(diào)查愈傷組織質(zhì)量。

1.2.4 不同形態(tài)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的表現(xiàn)

為探究將外植體處理成不同形狀后對(duì)愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間和愈傷組織量的影響，選擇莖段外植體，將其分別橫切成4～5 mm 厚的薄片、縱剖成1 cm 長(zhǎng)的小段，2 種形狀的莖段外植體接種到添加1.0 mg/L 6-BA 的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種形狀接種20～25 個(gè)，重復(fù)3 次。 分別在5 d、20 d、45 d 時(shí)調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)及分析方法

使用單因素方差分析(p＜0.01)，以Duncan 法進(jìn)行差異顯著性分析，所有分析均使用SPSS 進(jìn)行。

褐化率%=褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100

存活率%=存活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100

誘導(dǎo)率%=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100

1.4 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)中使用的基本培養(yǎng)基均為1/2MS 培養(yǎng)基， 添加瓊脂7 g/L、 蔗糖30 g/L， 調(diào)節(jié)pH 為5.8，121℃/0.1Mpa 滅菌20 min。 培養(yǎng)室溫度為25±1℃，光照時(shí)間為16 h/d，光照強(qiáng)度2000 1x。

2 結(jié)果與分析

2.1 0.1%升汞不同處理時(shí)間對(duì)外植體的污染率的影響

由圖2 可知滅菌時(shí)間對(duì)不同外植體污染率及褐化率的影響不同。其中鱗芽滅菌效果最差，升汞處理12 min鱗芽外植體仍有46.67%的污染率， 存活率僅有28.86%，故認(rèn)為鱗芽不適合進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。與鱗芽相比莖段和葉柄滅菌效果較好， 升汞處理3 min后只有26.66%和20.0%的污染率，繼續(xù)提高處理時(shí)間能夠繼續(xù)降低污染率但其存活率也會(huì)明顯下降，因此莖段和葉柄適宜處理時(shí)間為3 min。 為保證嫩葉有足夠高的成活率，升汞處理時(shí)間最長(zhǎng)可選擇8 min，此時(shí)污染率能夠降低到18.86%，因此嫩葉適宜的升汞處理時(shí)間為8 min。

圖2 4 種外植體不同滅菌時(shí)間下的污染率及存活率Figure 2 Contamination rate and survival rate of four explants under different sterilization time

從滅菌難度的角度來(lái)說(shuō)鱗芽不適宜用來(lái)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，而莖段、葉柄、嫩葉滅菌效果較為理想可用來(lái)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，且最適0.1%升汞處理時(shí)間分別為3 min、3 min、8 min。

2.2 褐化抑制劑對(duì)不同外植體褐化率及存活率的影響

在添加有褐化抑制劑的培養(yǎng)基中3 種外植體的褐化程度均低于對(duì)照，且不同褐化抑制劑對(duì)外植體褐化的抑制效果不同(見(jiàn)圖3)。 其中添加AC(活性炭)對(duì)莖段和嫩葉褐化的抑制作用與未添加相比均不明顯，只有在葉柄外植體中，添加1.0 g/L 的AC可使其褐化率降低16.31%；而添加500 mg/L 的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)能夠使3 種外植體的褐化率大幅降低，但濃度提高到1000 mg/L 并不能繼續(xù)降低褐化率；與PVP 相比Vc(維生素c)對(duì)3 種外植體褐化的抑制效果有明顯的劑量效應(yīng)，隨著其添加濃度的提高褐化率具有進(jìn)一步降低的趨勢(shì)。

圖3 3 種外植體在各處理中的褐化率Figure 3 Average Browning rate of three kinds of explants in each treatment

由此可知， 添加500 mg/L 的PVP 及15 mg/L Vc 能夠顯著降低3種外植體的褐化率， 而1.0g/L 的AC可有效抑制葉柄褐化。

2.3 激素對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種30 d 后，3 種外植體在不同培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織， 但3種外植體在不同培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率不同。 由表1 可知3 種外植體均在Y2 培養(yǎng)基中具有最高的愈傷組織誘導(dǎo)率且顯著高于其他水平，在此培養(yǎng)基中莖段、葉柄、葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為81.72%、84.95%、68.82%。 由圖4 可知在最佳培養(yǎng)基Y2 中3 種外植體愈傷組織生長(zhǎng)速度和愈傷組織量不同，5 d 時(shí)3 種外植體均未產(chǎn)生愈傷組織，15 d 時(shí)莖段和嫩葉已產(chǎn)生少量愈傷組織而葉柄尚未產(chǎn)生愈傷組織，30 d 時(shí)3 種外植體均已產(chǎn)生愈傷組織，其中莖段和葉柄產(chǎn)生的愈傷組織量明顯大于嫩葉，因此認(rèn)為莖段和葉柄更適合用來(lái)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

表1 不同激素濃度下三種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率Table 1 Callus induction rate of three explants under different hormone concentrations

2.4 不同形態(tài)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的表現(xiàn)

由圖5 可知，接種5 d 時(shí)薄片狀外植體形成層已有愈傷組織形成，而段狀外植體尚未形成愈傷組織。 接種20 d 時(shí)薄片狀外植體的愈傷組織已沿形成層產(chǎn)生一圈愈傷組織突起，而段狀外植體剛剛開(kāi)始形成愈傷組織。接種45 d 時(shí)薄片狀外植體和段狀外植體均已形成大量愈傷組織，其中薄片狀外植體已被完全被愈傷組織包裹，而段狀外植體僅一端產(chǎn)生愈傷組織團(tuán)。

圖5 不同形狀莖段外植體接種5d、20d、45d 時(shí)的愈傷組織誘導(dǎo)情況(圖中比例尺為0.5 cm)Figure 5 Callus induction of stem segment explants with different shapes after inoculation for 5d, 20d and 45d

3 結(jié)論與討論

3.1 褐化抑制劑對(duì)不同外植體褐化率及存活率的影響

褐化會(huì)嚴(yán)重影響植物材料的脫分化及再分化能力，褐化發(fā)生的最主要原因?yàn)閭谥卸喾宇愇镔|(zhì)與多酚氧化酶接觸，在酶促的作用下多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)影響植物生長(zhǎng)[11]。因此影響褐化的一個(gè)主要因素就是外植體的傷口大小[12]，而在3 種外植體中莖段和葉柄的傷口最大因此更易褐化。

本實(shí)驗(yàn)選擇了3 種褐化抑制劑：Vc(維生素C)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、AC(活性炭)，并安排了9 個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)對(duì)他們的褐化抑制作用進(jìn)行比較。 其中PVP 對(duì)莖段、葉柄、嫩葉的褐化率具有明顯抑制作用，這樣與國(guó)外在芍藥中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[13]。 而不同濃度AC 僅僅只對(duì)葉柄影響較大，對(duì)莖段、嫩葉影響不大，這可能是由于AC 抑制褐化是通過(guò)物理吸附作用，作用另2 種化學(xué)試劑導(dǎo)致[14]。 Vc 通過(guò)抑制醌類物質(zhì)氧化發(fā)揮作用，其對(duì)莖段、葉柄、嫩葉的褐化率均有較大影響。

3.2 激素對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)3 種外植體最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/L 6-BA，在此培養(yǎng)基中3 種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為81.72%、84.95%、68.82%。 不同的外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的表現(xiàn)不同，莖段和葉片愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間較葉柄更早，這可能是由于嫩葉和莖段處于較早的發(fā)育階段，響應(yīng)激素變化的速度更快[15]。 莖段和葉柄相比葉片愈傷組織產(chǎn)生的面積更大，莖段和葉柄整個(gè)橫斷面均可產(chǎn)生愈傷組織，而嫩葉僅有葉脈的傷口處產(chǎn)生愈傷組織。

3.3 不同形態(tài)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的差異

已有證據(jù)表明在植物的組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體的形狀對(duì)其再生效果具有重要影響[16]。 本研究通過(guò)比較段狀和薄片狀2 種形狀的外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的表現(xiàn)，得出薄片狀比段狀更適合進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。推測(cè)將外植體切割成不同形狀會(huì)影響其與培養(yǎng)基的接觸方式，以及外植體的傷口大小。外植體與培養(yǎng)基接觸面積越大會(huì)更有利于其吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還會(huì)使其更好地接受激素刺激。