金針菇菌根α-半乳糖苷酶在豆乳粉中的應用

李貞蓉 ，常明昌 ，2，徐麗婧 ，2，孟俊龍 ，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801）

豆乳是將大豆經(jīng)水浸泡后進行碾磨、過濾和煮制而成的一種植物蛋白飲料，其營養(yǎng)豐富且不含乳糖和膽固醇，利于人體消化吸收，為乳糖不耐癥人群提供選擇，而且還是防治高血脂、高血壓和動脈粥樣硬化等疾病的理想食品[1-2]。但大豆中含有1.9%的棉子糖和5.2%的水蘇糖[3]，這些寡糖又稱胃腸脹氣因子，不能被人體消化道的內(nèi)源酶降解，而腸道內(nèi)的產(chǎn)氣微生物卻可以利用其發(fā)酵產(chǎn)氣，從而引起腹脹、消化不良等癥狀[4-5]。據(jù)報道，嗜熱真菌費氏新薩托菌（Neosartorya fischeri P1）中的α-半乳糖苷酶添加于豆乳中，可以有效降解棉子糖家族寡糖，降低豆乳中的寡糖含量[6]。

金針菇（Flammulina velutipes）[7]是一種具有很高營養(yǎng)價值和藥用價值的真菌[8-9]，是世界六大主要食用菌之一[10-11]，具有極高的經(jīng)濟價值，2016年年產(chǎn)量已達266.9萬t[12]。隨著金針菇產(chǎn)量的提高，產(chǎn)生的廢棄物包括金針菇菌根也越來越多。目前，針對金針菇菌根的研究主要集中在多糖[13-14]、蛋白質(zhì)[15]、膳食纖維[16-17]、核苷酸[18]的提取上，而針對金針菇菌根α-半乳糖苷酶的提取和應用還鮮有報道。此外，金針菇菌根的食品研發(fā)相對較少，不能充分利用金針菇資源和提高其附加值。

山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院食用菌實驗室初步發(fā)現(xiàn)，金針菇子實體、菌根及發(fā)酵液中含有大量α-半乳糖苷酶，因此，本研究通過在豆乳中添加金針菇菌根粗酶液來制作金針菇菌根豆乳粉，檢測其降解豆乳中寡糖生成的還原糖的量，旨在為金針菇菌根的精深加工提供一種新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

金針菇新鮮子實體由山西農(nóng)業(yè)大學食用菌中心提供，大豆購自山西省太谷縣。

1.2 試劑

單甘酯、麥芽糊精為食品級，購自河南萬邦實業(yè)有限公司；3，5-二硝基水楊酸，購自Sangon Biotech公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，購自天津希恩思生化科技有限公司；無水碳酸鈉、無水乙酸鈉、冰乙酸、氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉，均為分析純，購自天津市凱通化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

LS-75HD型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；CHB-202型金屬浴，杭州博日科技有限公司；UV9100 A紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TDL5M-II型離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；GJJ-2/40型均質(zhì)機，上海諾尼輕工機械有限公司；SPRAY-2000型噴霧干燥機，上海熙揚儀器有限公司；DE-200g萬能高速粉碎機，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；JA5003N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；DZKW-D-1型水浴鍋，蘇州江東精密儀器有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；XP07型破壁料理機，佛山市順德區(qū)喜萊家電器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 金針菇α-半乳糖苷酶粗酶液的制備 將新鮮的金針菇子實體和新鮮的去除基部菌糠的金針菇菌根，清洗后瀝干水分。將二者各分成4份，分別進行-20℃冷凍保存、室溫（25℃）晾干、高溫（60℃）烘干及不做處理。

將新鮮和-20℃冷凍保存處理的分別加入1倍體積的生理鹽水，室溫晾干和高溫烘干處理的分別用高速粉碎機粉碎后，添加10倍體積的生理鹽水，4℃抽提過夜，8 500 r/min離心10 min，收集上清液，用截留分子量為3 ku的透析袋將上清液用去離子水充分透析，得到α-半乳糖苷酶粗酶液。

1.4.2 α-半乳糖苷酶酶活力的測定 根據(jù)JUDIT等[19]的方法測定α-半乳糖苷酶的活性，并稍加改動：取 20 μL酶液，加入 20 μL的 pNPG（10 mmol/L）底物溶液，40℃反應 10 min，加入 160 μL的Na2CO3（500 mmol/L）溶液來終止反應，在405 nm下測定吸光值。酶活力單位定義：在適宜pH和溫度下，每分鐘生成1 μmol對硝基酚的酶量為一個酶活力單位。

式中，A表示α-半乳糖苷酶的酶活力（U/mL）；Ax表示樣品酶液的吸光值；Ao表示對應酶液的空白吸光值；K表示對硝基酚標準曲線的斜率；Co表示對硝基酚標準曲線的截距；Df表示稀釋倍數(shù)；V表示反應所用酶量（mL）；t表示反應時間（min）。

1.4.3 金針菇菌根中α-半乳糖苷酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測定

1.4.3.1 最適溫度的測定 酶活力測定時，改變反應溫度，將反應溫度分別設為 10、20、30、40、50、60、70、80、90℃，其他條件不變，測定酶活力，將酶活力最高值設為100%，計算各溫度下α-半乳糖苷酶的相對活力并對溫度作圖。

1.4.3.2 溫度穩(wěn)定性的測定 酶活力測定前，將酶液分別在 4、10、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃下保溫2 h，后測定殘余酶活，以未保溫（4℃）的酶活力作為100%，計算各溫度下的殘余酶活。

1.4.4 金針菇豆乳粉制作工藝流程 大豆→篩選→清洗→晾干→磨粉→浸提→過濾→將濾液與金針菇菌根粗酶液按比例混合→加入麥芽糊精、單甘酯進行調(diào)配→殺菌→均質(zhì)→噴霧干燥→得到金針菇豆乳粉。

1.4.5 金針菇豆乳粉操作工藝要點

1.4.5.1 浸提、過濾 將磨好的大豆粉與蒸餾水按1∶4的料液比混合，90℃浸提1 h，用0.1 mm紗布過濾除渣，濾液即為豆乳[20-21]。

1.4.5.2 調(diào)配 將金針菇菌根粗酶液與濾液按體積比3∶7混合，40℃下反應3 h，后加入0.010 g/mL單甘酯和0.15 g/mL麥芽糊精進行調(diào)配[1]。

1.4.5.3 殺菌 調(diào)配好的豆乳于121℃下加熱殺菌15 min[22-23]。

1.4.5.4 均質(zhì) 均質(zhì)前要將混合液使用0.1 mm紗布進行過濾，去除混合液中的殘留，防止均質(zhì)過程中堵塞儀器，均質(zhì)壓力設為20 MPa。

1.4.5.5 噴霧干燥 將均質(zhì)后的液體進行噴霧干燥，干燥條件是：進口溫度180℃、出口溫度60℃、物料流量16 mL/min，由此得到金針菇豆乳粉[24]。

1.4.6 不同大豆與水的料液比下金針菇豆乳粉得率的測定 在基礎工藝條件下，設大豆與水的料液比分別為 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）等 5 個水平的單因素試驗，計算其得率，確定大豆與水的最適料液比。

式中，M1表示噴霧干燥所得金針菇豆乳粉的質(zhì)量（g）；M2表示所用原料大豆粉的質(zhì)量（g）。

1.4.7 還原糖的測定

1.4.7.1 葡萄糖標準曲線繪制 以葡萄糖含量為縱坐標，以不同濃度的葡萄糖在540 nm處所對應的吸光值為橫坐標，繪制標準曲線（圖1），得到y(tǒng)＝25.843x－0.953 2（R2＝0.999 8）。

1.4.7.2 還原糖含量的測定方法 依據(jù)MILLER[24]的方法進行還原糖含量的測定。樣品為加入金針菇菌根粗酶液后的豆乳，取樣品溶液1 mL，加入1 mL蒸餾水、1.5 mL水楊酸，對照組用未加入金針菇菌根粗酶液的豆乳代替樣品，混合均勻，沸水浴5 min后，立即用冷水冷卻到室溫，每管各加入21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定其吸光值，通過葡萄糖標準曲線得到的公式計算樣品中的還原糖含量。

1.4.8 金針菇豆乳粉的感官評定 金針菇豆乳粉以1∶10的比例用開水沖調(diào)后，由10人（5男5女）組成的評價小組分別對產(chǎn)品的滋味、色澤、氣味和沖調(diào)性進行感官評價，滿分為100分[24-25]。金針菇豆乳粉的感官評價標準列于表1。

表1 金針菇豆乳粉產(chǎn)品感官評價

1.4.9 單因素試驗設計 在基礎工藝條件下進行單因素試驗，試驗設計為：金針菇菌根粗酶液與豆乳體積比分別為 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5，金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應溫度分別為20、30、40、50、60℃，金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應時間分別為 1、2、3、4、5 h，單甘酯添加量分別為 0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 g/mL，麥芽糊精添加量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL，噴霧干燥進口溫度分別為 160、170、180、190、200 ℃。通過單因素試驗篩選出各因素的最佳條件，為響應面試驗提供參考依據(jù)。

1.4.10 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，選取金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比（A）、噴霧干燥進口溫度（B）、單甘酯添加量（C）以及麥芽糊精添加量（D）4個因素為自變量，以金針菇豆乳粉感官評分為響應值，通過Design-Except 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應面分析試驗。試驗因素及水平列于表2。

表2 響應面試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對金針菇子實體和菌根中α-半乳糖苷酶酶活力的影響

分別檢測了金針菇子實體和菌根在4種不同處理方式下的α-半乳糖苷酶酶活力。由圖2可知，在4種狀態(tài)下，金針菇子實體和菌根中均含有α-半乳糖苷酶，且金針菇菌根中α-半乳糖苷酶酶活力遠高于金針菇子實體中的酶活力。由此可知，金針菇菌根可以作為α-半乳糖苷酶的良好來源。其中，新鮮狀態(tài)下α-半乳糖苷酶的酶活力最高，室溫晾干的次之。此外，實際生產(chǎn)中最常見的干制方式高溫烘干會導致酶活力大量損失，金針菇子實體約損失70%，金針菇菌根約損失40%。因此，在后續(xù)試驗中，均采用常見的室溫晾曬后的金針菇菌根作為α-半乳糖苷酶粗酶液的來源。

2.2 金針菇菌根α-半乳糖苷酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性分析

從圖3可以看出，金針菇菌根的α-半乳糖苷酶在反應溫度為50℃時，酶活力最高，設為100%；反應溫度為40℃時，殘余酶活為60%左右；反應溫度達到60℃時，有40%左右的酶活。其余反應溫度下，酶活均低于30%；當反應溫度為90℃時，基本喪失活性。結果表明，50℃為金針菇菌根的α-半乳糖苷酶最適反應溫度。

由圖4可知，該酶的熱穩(wěn)定性整體呈現(xiàn)下降趨勢。將4℃溫育2 h后測得的酶活力設為100%；在10℃溫育2 h后，相對酶活在80%附近；20～40℃溫育2 h后，相對酶活在70%左右；40℃后酶活力急劇下降，50℃溫育2 h后，相對酶活僅有20%左右；當溫度達到70℃以上后檢測不到活性。溫度穩(wěn)定性結果表明，金針菇菌根的α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性在40℃以下溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

在最適反應溫度50℃下，金針菇菌根中的α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性較低，殘余酶活僅有30%左右；溫度為4～40℃時，酶的熱穩(wěn)定性較好且反應溫度為40℃時，酶活力較高，因此，后續(xù)單因素試驗中選擇40℃作為反應溫度。

2.3 大豆與水的料液比對金針菇豆乳粉得率的影響

在豆乳粉制作過程中，大豆與水的料液比直接影響金針菇豆乳粉的得率。由圖5可知，隨著大豆與水的料液比不斷減小，得率整體呈現(xiàn)下降趨勢，在大豆與水的料液比為1∶3時，得率最高。1∶4的豆乳粉得率略小于1∶3的。但由于大豆與水的料液比為1∶3時，物料過于濃稠，后續(xù)操作較為困難。因此，確定大豆與水的適宜料液比為1∶4（g/mL）。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比對豆乳粉中α-半乳糖苷降解效果和感官評分的影響 將金針菇菌根粗酶液和豆乳分別以體積比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5 混合，以未加入金針菇菌根粗酶液的豆乳作為空白對照組，在40℃下放置3 h，檢測其生成的還原糖含量。

從圖6可以看出，當金針菇比例不斷增加時，生成的還原糖含量呈現(xiàn)上升趨勢，而感官評分呈先增高后降低，在金針菇菌根粗酶液與豆乳體積比為3∶7時，入口無金針菇腥味，金針菇與豆乳體積比剛好合適，感官評分最高。綜上所述，確定金針菇菌根粗酶液與豆乳最適體積比為3∶7。

2.4.2 金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應時間對豆乳粉中α-半乳糖苷降解效果和感官評分的影響混合金針菇菌根粗酶液和豆乳，以未加入金針菇菌根粗酶液的豆乳作為空白對照組，在40℃分別放置 1、2、3、4、5 h，檢測其生成的還原糖含量。由圖 7可知，隨著金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應時間不斷增加，還原糖含量一直增大，反應時間為3 h時，還原糖的量達到最大，反應時間為4 h，還原糖的量不再繼續(xù)增加。而隨著反應時間的延長，感官評分雖有所提高，但無明顯差異。因此，綜合考慮，確定金針菇菌根粗酶液與豆乳的最適反應時間為3 h。

2.4.3 金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應溫度對豆乳粉中α-半乳糖苷降解效果和感官評分的影響混合金針菇菌根粗酶液和豆乳，以未加入金針菇菌根粗酶液的豆乳作為空白對照組，在20、30、40、50、60℃的反應溫度分別放置3 h，檢測其生成的還原糖含量。由圖8可知，隨著金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應時間不斷增加，還原糖含量一直增大，反應溫度為40℃時，還原糖的量達到最大。溫度繼續(xù)提高，還原糖的生成量反而降低，可能是由于長時間高溫導致部分α-半乳糖苷酶變性，溫度穩(wěn)定性降低所致。而隨著反應時間的延長，感官評分雖有所變化，但無明顯差異。因此，綜合考慮，確定金針菇菌根粗酶液與豆乳的最適反應溫度為40℃。

2.4.4 單甘酯添加量對金針菇豆乳粉感官評分的影響 從圖9可以看出，隨著單甘酯添加量的不斷增大，金針菇豆乳粉的感官評分先增加后趨于穩(wěn)定。在單甘酯添加量為0.010 g/mL時，感官評分最高。此時豆乳粉干燥效果較好，呈淡黃色，色澤均勻，沖調(diào)時易溶解，幾乎無團塊，且沖調(diào)后較穩(wěn)定，無分層現(xiàn)象。此后隨著單甘酯添加量繼續(xù)增加，感官評分不再增加。綜上所述，確定單甘酯最適添加量為0.010 g/mL。

2.4.5 麥芽糊精添加量對金針菇豆乳粉感官評分的影響 由圖10可知，當麥芽糊精添加量為0.05～0.20 g/mL時，金針菇豆乳粉的感官評分隨著麥芽糊精添加量的增加而增大。在麥芽糊精添加量為0.20 g/mL時，感官評分最高。此時豆乳粉沖調(diào)后甜度適中，豆香味明顯，無金針菇的苦腥味。當麥芽糊精添加量繼續(xù)增加，豆香味減弱，且有明顯的糊精味。綜上所述，確定麥芽糊精最適添加量為0.20g/mL。

2.4.6 噴霧干燥進口溫度對金針菇豆乳粉感官評分的影響 由圖11可知，隨著噴霧干燥進口溫度的升高，感官評分先增大后減小。當進口溫度為180℃時，感官評分最高。當進口溫度較低時，水分蒸發(fā)不徹底，顆粒之間出現(xiàn)黏結，沖調(diào)性較差，有大量團塊。當進口溫度過高時，豆乳粉沖調(diào)后不易潤濕，溶解時間較長。因此，確定最適噴霧干燥進口溫度為180℃。

2.5 響應面法試驗結果

2.5.1 響應面法試驗設計與結果 Box-Behnken響應面的試驗方案及結果列于表4。由表4可知，金針菇豆乳粉的最佳生產(chǎn)條件為：金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比為3∶7、噴霧干燥進口溫度為180℃、單甘酯添加量為0.010 g/mL、麥芽糊精添加量0.20 g/mL，感官評分為95分。

2.5.2 響應面回歸模型的方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的數(shù)據(jù)進行回歸擬合和方差分析，得到回歸方程為：Y＝91.00－3.75A－3.50B＋1.92C＋2.00D＋3.00AB＋0.75AC＋0.50AD＋4.25BC ＋3.25BD －6.25CD －10.29A2－8.42B2－ 7.79C2－8.67D2。

表4 響應面試驗設計及結果

從表5可以看出，模型的多元相關性系數(shù)R2為0.939 9，說明金針菇豆乳粉的感官評分變化93.99%都是因為自變量?；貧w模型的P值小于0.000 1，差異高度顯著，失擬項值為0.846 3，差異不顯著，說明方程與實際情況擬合比較好，試驗誤差較小，該模型可靠。A、CD、A2、B2、C2、D2項差異高度顯著，B項差異極顯著，AB、AC、AD、BC、BD項差異顯著，由F值可知，4個因素的影響順序為A＞B＞D＞C。圖12為響應面的三維曲面圖，反映了響應值與變量之間的相互關系。由圖12可知，A、B、C、D這4個因素之間存在交互作用關系，且曲面越陡峭，說明2個因素之間的交互作用越顯著。

表5 回歸方程方差分析

2.6 驗證試驗結果

響應面試驗結果經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化，得到金針菇豆乳粉的最佳生產(chǎn)工藝為：金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比2.86∶7.14、噴霧干燥進口溫度177.1℃、單甘酯添加量0.009 9 g/mL、麥芽糊精添加量0.197 5 g/mL。該條件下金針菇豆乳粉的感官評分預測值為92.020 6分。由于實際操作限制，最佳工藝條件修正為：金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比3∶7、噴霧干燥進口溫度177℃、單甘酯添加量0.010 g/mL、麥芽糊精添加量0.20 g/mL。采用上述優(yōu)化條件做驗證試驗，重復3次，得到感官評分為92分，相對標準偏差（RSD）為0.010 9，與理論數(shù)值非常接近。所以，響應面法分析得到的該 模型可靠，具有實用價值。

3 結論與討論

本研究以金針菇菌根、大豆為主要原料，通過在豆乳中添加金針菇菌根的α-半乳糖苷酶粗酶液，采用單因素和響應面法，確定了金針菇豆乳粉的最佳生產(chǎn)工藝：大豆與水的料液比為1∶4（g/mL）、金針菇菌根粗酶液與豆乳的體積比為3∶7、金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應時間為3 h、金針菇菌根粗酶液與豆乳的反應溫度為40℃、單甘酯添加量為0.010 g/mL、麥芽糊精添加量為0.20 g/mL、噴霧干燥進口溫度為177℃。研制出一款色澤、氣味、口感均良好的金針菇豆乳粉，可為金針菇菌根的利用及精深加工提供一定理論依據(jù)。本試驗是利用金針菇中α-半乳糖苷酶可以降解寡糖這一原理，將其添加到豆乳中來制作金針菇豆乳粉，但是降解寡糖的種類及作用機制并不清楚，后期可以對其進行探討及研究。加工過程中噴霧干燥的出口溫度、物料流量等并未進行優(yōu)化試驗，因此，后續(xù)可以對金針菇豆乳粉的噴霧干燥工藝進行優(yōu)化試驗。