NF-κB家族亞基在不同品種綿羊背部皮膚中基因水平表達(dá)差異的分析

吳佳豪，董亞潔，張嬌嬌，陸 娜，薛霖莉，曹校瑞，張鵬翔，赫曉燕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

隨著人們生活水平的提高，毛紡織業(yè)的需求量日益增加，而羊毛的產(chǎn)量與質(zhì)量直接影響著毛紡織業(yè)的發(fā)展。羊毛的質(zhì)量指標(biāo)主要有彎曲度、細(xì)度、密度、長度等，其中，彎曲度是其重要的生產(chǎn)性狀之一，對加工過程中羊毛斷裂損耗及毛紡品的柔軟度具有重要的影響。美利奴羊引自國外，毛被質(zhì)量均勻且密度大，毛發(fā)細(xì)長彎曲數(shù)多，是毛紡織品的優(yōu)良原料；小尾寒羊是我國肉裘兼用型綿羊品種，毛較粗直呈波形或平展無彎，雖長度、細(xì)度和彎曲度都不及美利奴羊毛，但因其數(shù)量大、種類多，而成為毛紡織工業(yè)的主要原料，其紡織品質(zhì)量較美利奴羊毛紡織品差。因此，若能改善小尾寒羊毛發(fā)彎曲性狀，將對毛紡織工業(yè)具有重要意義[1]。

皮膚是機(jī)體重要的屏障和保護(hù)器官，毛囊是皮膚重要而復(fù)雜的附屬結(jié)構(gòu)，而毛發(fā)作為毛囊細(xì)胞增殖和分化的產(chǎn)物，是皮膚的衍生物[2]。因此，欲改善綿羊毛發(fā)彎曲性狀，首先要了解毛發(fā)彎曲的分子調(diào)控機(jī)制，同時研究毛囊的發(fā)育生物學(xué)。近年來，有關(guān)毛發(fā)生長及發(fā)育的研究已有一定進(jìn)展，但有關(guān)羊毛彎曲性狀形成的分子機(jī)制研究并不多見，以至于影響羊毛彎曲性狀形成的機(jī)制仍然沒有系統(tǒng)的概述[3]。近20 a來，對小鼠、人等哺乳動物毛發(fā)纖維彎曲形成調(diào)控機(jī)制進(jìn)行的研究雖已有了很大進(jìn)展，但由于同源性的差異，羊毛彎曲性狀形成的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。盡管不同種動物毛發(fā)的長度、細(xì)度、彎曲度等特性差異明顯，且形成這些差異的分子機(jī)制尚不十分明確，但因毛囊發(fā)生、發(fā)育和毛發(fā)生長的分子調(diào)控機(jī)制被發(fā)現(xiàn)在許多哺乳動物中是相似的，這便為進(jìn)一步探究羊毛彎曲形成的分子機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)[3-4]。

目前，已發(fā)現(xiàn)多個參與毛發(fā)生長發(fā)育和毛囊形態(tài)發(fā)生所需的信號通路，如Wnt和EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路等[5-8]。這些信號通路中的配體、受體、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的遺傳突變、表觀遺傳修飾和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的改變等都會影響動物毛囊發(fā)育，造成毛發(fā)生長和品質(zhì)方面的變化[8-12]。同時，眾多文獻(xiàn)表明，NF-κB與EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路關(guān)系密切，而EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路對于毛發(fā)彎曲性狀的形成具有重要影響，因此，NF-κB存在對羊毛彎曲調(diào)控的可能性[13-17]。

NF-κB是SEN等于1986年首次在成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)重要作用的核蛋白因子，因其能與B細(xì)胞免疫球蛋白親鏈基因的增強(qiáng)子（κB序列）特異性結(jié)合而得名。隨后研究了解到，NF-κB廣泛存在于組織細(xì)胞中，成分并不單一，由5種相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，是一個大家族，它們分別是：NFκB1、NFκB2、RELA、RELB 和REL[18-21]。

本試驗(yàn)選取美利奴羊和晉中綿羊（屬小尾寒羊）2個不同品種的綿羊作為研究對象，利用實(shí)時熒光定量PCR方法對不同品種綿羊背部皮膚中NF-κB各亞基的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，旨在了解NF-κB家族各亞基基因水平的表達(dá)差異，分析在不同品種綿羊背部皮膚中與形成毛發(fā)性狀差異相關(guān)的關(guān)鍵性基因，旨在為了解毛發(fā)性狀形成相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制提供途徑，為進(jìn)一步改善晉中綿羊毛發(fā)彎曲性狀、促進(jìn)毛紡織工業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物及取材

選取山西省介休種羊場以相同條件飼喂的健康雌性3歲齡白色美利奴羊和晉中綿羊各4只。剃除各自背部相同部位的毛發(fā)后，利用取皮器進(jìn)行皮膚樣品采集，經(jīng)生理鹽水清洗處理后，置于液氮中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolReagent（Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）；SYBR PremixExTaqTMⅡ（TaKaRa公司）。

微量移液槍（Eppendorf公司）；超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；ND-1000微量核酸蛋白測定儀（NanoDrop Technologies公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；梯度PCR儀（Eppendorf公司）；MultilageTMLight Cabinet Filter Positions（Alpha Innotech 公司）；Mx3005PTMMultiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 以綿羊的18S rRNA作為內(nèi)參基因。根據(jù)NCBI中登錄的羊?qū)貼FκB1（登錄號：XM_027970852.1）、NFκB2（登錄號：XM_027960 471.1）、RELA（登錄號：XM_027959295.1）、RELB（登錄號：XM_015100238.2）、REL（登錄號：XM_027966 801.1）與 18S rRNA（登錄號：XR_003587981.1）CDS區(qū)的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，引物信息如表1所示。引物均由華大公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.2 提取總RNA 取液氮凍存的取材組織，按照Trizol試劑盒說明書分別提取美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚組織樣品中的總RNA；提取的總RNA使用ND-1000微量核酸蛋白測定儀，測定其純度及濃度，并利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總RNA的完整性。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 以檢驗(yàn)合格的組織總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser（參照其說明書）反轉(zhuǎn)錄得到2種綿羊樣本的cDNA模板，并調(diào)整濃度為100 ng/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR 以1.3.3反轉(zhuǎn)錄得到的2種綿羊樣本背部皮膚組織的cDNA為模板，以18SrRNA為內(nèi)參基因，使用SYBRPremixExTaqTMⅡ（參照其說明書）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，每個樣本進(jìn)行4次有效重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA1μL，SYBR PremixExTaqTMⅡ（2×）5 μL，ROXReference Dye 0.2 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各 0.4 μL，ddH2O3.0μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95 ℃變性 30 s，退火 30 s（表 1），72 ℃延伸 20 s，40個循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s。熒光信號值在退火時收集。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時熒光定量擴(kuò)增所得Ct值，結(jié)果利用2-ΔΔCt法計算NF-κB家族各亞基在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中mRNA的相對表達(dá)量；利用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，其中，ns表示P＞0.05差異不顯著，*表示P＜0.05差異顯著，***表示P＜0.001差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種綿羊背部皮膚組織樣本總RNA的提取

為探究NF-κB家族各亞基在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中基因水平的表達(dá)差異，提取美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚組織樣本的總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均可見5S、18S和28S這3條帶，證明提取的各樣本總RNA中基因組和蛋白質(zhì)污染去除干凈。同時經(jīng)ND-1000微量核酸蛋白測定儀測定可知，所有樣本總RNA的A260/A280值均在1.8～2.0。證明提取的各樣本總RNA質(zhì)量較好，符合后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和定量分析試驗(yàn)的要求。

2.2 NF-κB家族單個亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中的定量表達(dá)

通過實(shí)時熒光定量PCR試驗(yàn)，以18S rRNA作為內(nèi)參基因測定了目的基因在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖1～5所示，利用 2-ΔΔCt法計算得出，NFκB1 mRNA 在美利奴羊背部皮膚中的相對表達(dá)量是晉中綿羊的1.897倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達(dá)量是晉中綿羊的2.025倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達(dá)量是晉中綿羊的0.619倍，且差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；RELB mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達(dá)量是晉中綿羊的1.791倍，但差異不顯著（P＞0.05）；REL mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達(dá)量是晉中綿羊的1.819倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）。NF-κB各亞基mRNA在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中的相對表達(dá)量均有差異，除RELA外其余各亞基mRNA的相對表達(dá)量在美利奴羊皮膚中均高于晉中綿羊。

2.3 美利奴羊背部皮膚中NF-κB家族各亞基的定量表達(dá)

在美利奴羊背部皮膚樣本中，NF-κB家族各亞基mRNA表達(dá)情況如圖6所示，RELB mRNA相對表達(dá)量最低，NFκB1 mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的83.631倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA 相對表達(dá)量是 RELB mRNA的132.871倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的94.085倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；RELB mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的26.129倍，且差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.4 晉中綿羊背部皮膚中NF-κB家族各亞基的定量表達(dá)

在晉中綿羊背部皮膚樣本中，NF-κB家族亞基mRNA表達(dá)情況如圖7所示，RELBmRNA相對表達(dá)量最低，NFκB1 mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的78.960倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA相對表達(dá)量是 RELB mRNA的117.527倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的272.238倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；REL mRNA相對表達(dá)量是RELB mRNA的25.732倍，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

羊毛是由皮膚內(nèi)的毛囊發(fā)育而來的，毛囊在皮膚上成群分布，其生長是一個非常復(fù)雜的生理生化過程，主要包括毛乳頭可增殖細(xì)胞旺盛的分裂、分化、角質(zhì)化和遷移等過程。經(jīng)過毛囊周期過程中生長期、退行期和休止期的不斷更替，毛球與毛乳頭間的營養(yǎng)聯(lián)系不斷變化，毛球細(xì)胞增殖過程受其影響，毛根形態(tài)因此而發(fā)生改變，毛纖維在毛鞘內(nèi)的狀態(tài)也隨之產(chǎn)生變化，從而使羊毛發(fā)生性狀方面的改變，如粗細(xì)、長短和彎曲程度方面的改變等[17]。因此，綿羊毛發(fā)性狀取決于其皮膚內(nèi)毛囊的結(jié)構(gòu)和特性[2]。

毛囊的生長發(fā)育狀況非常復(fù)雜，受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等多方面的影響，不同品種動物毛囊的結(jié)構(gòu)特性差異明顯，因而不同物種所表現(xiàn)出的毛發(fā)性狀也各不相同。越來越多的研究表明，不論是遺傳、環(huán)境還是飼養(yǎng)條件的差異，所造成的影響都會通過體內(nèi)分泌產(chǎn)生的一些相關(guān)細(xì)胞因子作為中介來實(shí)現(xiàn)其想要產(chǎn)生的結(jié)果[4]，即毛囊結(jié)構(gòu)和特性的差異實(shí)際是受細(xì)胞因子表達(dá)水平的強(qiáng)烈制約和影響的。作為體內(nèi)分泌協(xié)調(diào)基因和環(huán)境的重要因子，細(xì)胞因子及其受體構(gòu)成了調(diào)控毛囊形成發(fā)育和毛囊周期性生長的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，繼而對羊毛生長的調(diào)控起著極其重要的作用[3，22]。因此，毛發(fā)性狀差異可能就是細(xì)胞因子表達(dá)水平差異的結(jié)果[23]。

本研究通過實(shí)時熒光定量PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NF-κB家族各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達(dá)量存在差異。其中，NFκB1、NFκB2、RELB、REL 這 4 個亞基 mRNA 在美利奴羊的相對表達(dá)量均高于晉中綿羊，且分別是后者的 1.897倍（P＜0.001）、2.025倍（P＜0.001）、1.791倍（P＞0.05）、1.819倍（P＜0.001），表現(xiàn)出與性狀差異的正相關(guān)性，表明美利奴羊良好的彎曲性狀可能受到四者或四者之中某個亞基或某2個、某3個的正調(diào)控作用。與其他4個亞基形成鮮明對比的是RELA亞基mRNA在美利奴羊的相對表達(dá)量僅為晉中綿羊的0.619倍（P＜0.05），表現(xiàn)出與性狀差異的負(fù)相關(guān)性，表明美利奴羊的彎曲性狀可能受到其負(fù)調(diào)控作用。有研究表明，當(dāng)毛乳頭中角質(zhì)形成細(xì)胞分裂、遷移速率加快并引發(fā)角質(zhì)化過程時，毛發(fā)纖維是直的；當(dāng)細(xì)胞分裂、遷移速率過慢使角質(zhì)化速率降低時，角質(zhì)化可能發(fā)生在真皮乳頭，此時毛發(fā)纖維呈卷曲狀[14，24]。RELA對于細(xì)胞的分裂、分化和凋亡起著重要的調(diào)控作用，細(xì)胞的分裂水平和能力與RELA表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)[25]。本試驗(yàn)表明，可能由于美利奴羊RELA mRNA的相對表達(dá)水平顯著低于晉中綿羊，從而使得形成毛纖維的角質(zhì)形成細(xì)胞分裂能力較晉中綿羊更低，因此使得毛發(fā)的彎曲性狀比晉中綿羊更顯著。

單一物種方面，美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中RELB、REL的相對表達(dá)量都很低，這與文獻(xiàn)中RELB主要見于胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官中參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，而REL多見于造血細(xì)胞中的表述相符[19-20]。美利奴羊中，NFκB2 mRNA的相對表達(dá)量最高，RELA mRNA次之，表明NFκB2可能對于其毛發(fā)性狀的形成影響更為直接；而晉中綿羊中，RELA mRNA的相對表達(dá)量最高，NFκB2 mRNA次之，表明RELA對于其毛發(fā)性狀的形成影響可能更大。結(jié)合各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達(dá)量結(jié)果推測，NFκB2與RELA適當(dāng)?shù)南鄬Ρ磉_(dá)水平對于毛發(fā)的彎曲性狀可能具有重要的調(diào)控作用。

EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路的激活是一復(fù)雜的生理過程，即EDA-A1與其受體EDAR結(jié)合進(jìn)而激活胞內(nèi)受體EDARadd，然后釋放出大量游離的NF-κB，NF-κB入核并調(diào)控核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)多種生理活動[5，10]。同時，眾多文獻(xiàn)表明，該家族成員以一定的形式兩兩結(jié)合，形成不同的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與核DNA特異性結(jié)合的位點(diǎn)不同，有的促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，有的則抑制基因轉(zhuǎn)錄[20-22]。若要進(jìn)一步了解NF-κB對于毛發(fā)性狀形成的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制，則需做進(jìn)一步的探索和研究。

本試驗(yàn)表明，NF-κB 家族的 NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達(dá)量均有差異，其中，美利奴羊皮膚中NFκB2mRNA相對表達(dá)量最高，RELA mRNA次之；而晉中綿羊皮膚中，RELAmRNA相對表達(dá)量最高，NFκB2 mRNA次之。揭示NFκB2可能對于羊毛彎曲性狀的形成具有促進(jìn)作用，RELA可能對于羊毛彎曲性狀的形成具有抑制作用，并且NFκB2與RELA適當(dāng)?shù)南鄬Ρ磉_(dá)水平可能對于毛發(fā)彎曲性狀的形成起重要的調(diào)控作用。