不同程度宮頸癌前病變患者陰道菌群的群落差異分析

劉 星

宮頸癌為我國(guó)女性較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有女性惡性腫瘤中位居第二，在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居首位，隨著人們生活方式及生活環(huán)境的不斷改變，宮頸癌的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性生命健康［1，2］。 宮頸癌前病變（cervical intraeptithelial neoplasia，CIN）主要是指女性具有癌變風(fēng)險(xiǎn)，但臨床尚未診斷為原位癌的一類宮頸異常增殖性病變，極有可能發(fā)展為宮頸癌［3］。眾所周知，女性陰道菌群在陰道微環(huán)境穩(wěn)定保護(hù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，陰道微生物可能在宮頸病變發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［4］。然而，上述觀點(diǎn)尚存在一定的爭(zhēng)議，既往研究中主要是依靠采集女性陰道分泌物涂片與陰道功能性指標(biāo)等途徑評(píng)價(jià)陰道微生態(tài)，然而實(shí)際工作中受多種因素的影響，可能會(huì)對(duì)實(shí)際結(jié)果產(chǎn)生影響。鑒于此，該文通過(guò)對(duì)比不同程度宮頸癌前病變患者陰道菌群群落差異，旨在為臨床宮頸癌前病變的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取筆者所在醫(yī)院2017年2月—2019年2月收治的宮頸癌前病變患者117例作為研究對(duì)象。年齡 23～58 歲，平均（39.84±5.22）歲；文化程度：初中及初中以下50例，高中及高中以上67例。將其按照患者宮頸癌前病變程度的差異分成CINⅠ組39例、CINⅡ組34例以及CINⅢ組44例。另取同期接受體檢的健康女性40名作為對(duì)照組，年齡 24～59 歲，平均（39.88±5.25）歲；文化程度：初中及初中以下16例，高中及高中以上24例。兩組上述指標(biāo)比較，差異不顯著（P＞0.05），均衡可比。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）宮頸癌前病變患者均與《宮頸癌前病變以及宮頸癌檢查教程》［5］中所制定的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)相符；（2）均為已婚女性；（3）入院前 1個(gè)月內(nèi)為接受抗生素以及陰道沖洗藥物干預(yù)；（4）年齡≥18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1周內(nèi)有性生活、陰道異常分泌物以及流血者；（2）合并泌尿生殖器炎癥者；（3）心、肝、腎等重要臟器發(fā)生病變者；（4）具有長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇以及免疫抑制劑史者；（5）意識(shí)障礙或伴有精神疾病者；（6）正參與其他研究者。研究對(duì)象知情同意，且醫(yī)院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)該研究。

1.2 研究方法 （1）以無(wú)菌棉拭子在所有受試者陰道后穹窿處轉(zhuǎn)動(dòng)15 s左右，待其充分吸收受試者陰道內(nèi)分泌物后置入干燥無(wú)菌試管內(nèi)，將采集好的標(biāo)本放置在冰箱中保存，用于細(xì)菌基因組提取。細(xì)菌基因DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以稀釋提取的基因組作為模板，引物序列如下：5’-ACTCCTACGGGAGGCAG GAG-3’，5’ -GGACTACHVGGTWTCATAAT-3’。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠實(shí)施電泳檢測(cè)，并按照其PCR產(chǎn)物濃度予以等量混合。生物信息學(xué)分析以MiSeq軟件的默認(rèn)指數(shù)對(duì)其原始測(cè)序數(shù)據(jù)予以測(cè)定，在去除接頭數(shù)列以及低質(zhì)量數(shù)列的預(yù)處理，通過(guò)其命令對(duì)標(biāo)本菌群的主成分分析和不同組件群落結(jié)構(gòu)以及菌群差異。（2）血清炎癥因子水平檢測(cè)：分別于所有受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，采集靜脈血5 ml，以3000 r/min作為離心條件進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為10 min的離心處理，取上層血清保存在-80℃冰箱中待檢。檢測(cè)方式為酶聯(lián)免疫吸附法，具體操作嚴(yán)格遵從試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，相關(guān)試劑盒均購(gòu)自上海康郎生物科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo) 比較四組人員多樣性指數(shù)，陰道菌群類型，陰道菌群檢出情況，血清炎癥因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示。

2 結(jié)果

2.1 四組人員多樣性指數(shù)對(duì)比 CINⅠ組Chao指數(shù)、ACE指數(shù)相較于CINⅡ組、CINⅢ組、對(duì)照組明顯更高（P＜0.05）；而四組在辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 四組人員多樣性指數(shù)對(duì)比（x±s）

2.2 四組陰道菌群類型對(duì)比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、對(duì)照組的陰道菌群類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 四組陰道菌群類型對(duì)比［例（%）］

2.3 四組陰道菌群檢出情況對(duì)比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組乳酸桿菌檢出率均顯著低于對(duì)照組，且CINⅡ組、CINⅢ組解脲支原體、衣原體檢出率亦顯著高于對(duì)照組；四組霉菌以及滴蟲(chóng)檢出率對(duì)比差異均不明顯，見(jiàn)表3。

表3 四組陰道菌群檢出情況對(duì)比［例（%）］

2.4 四組血清炎癥因子水平對(duì)比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組血清IL-2水平均顯著低于對(duì)照組，IL-4水平顯著高于對(duì)照組，且CINⅡ組、CINⅢ組血清IFN-γ水平顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)表4。

表4 四組血清炎癥因子水平對(duì)比（例，x±s）

3 討論

陰道微生態(tài)環(huán)境主要是由內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、微生態(tài)菌群、解剖結(jié)構(gòu)組成，相關(guān)研究表明，每個(gè)育齡女性可分離6～8種微生物，且以細(xì)菌為主，并會(huì)隨著年齡以及妊娠等變化隨之發(fā)生演變［6-8］。作為一種生物屏障，陰道菌群存在于陰道黏膜上皮以及陰道分泌液中，可發(fā)揮防御外襲菌侵入，激活宿主免疫反應(yīng)以及維持陰道環(huán)境等多種功效［9］。宮頸暴露在陰道中，正常情況下陰道微環(huán)境處于平衡狀態(tài)，一旦該平衡被打破，則會(huì)促使微生物入侵，繼而引發(fā)宮頸病變，對(duì)女性的生命健康安全造成嚴(yán)重威脅［10］。

該文結(jié)果顯示，CINⅠ組Chao指數(shù)、ACE指數(shù)相較于CINⅡ組、CINⅢ組、對(duì)照組明顯更高；而四組在辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)方面對(duì)比均不明顯，說(shuō)明了CINⅠ患者相較于健康女性，其陰道部分菌群豐度增加。此外，CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組乳酸桿菌檢出率均顯著低于對(duì)照組，且CINⅡ組、CINⅢ組解脲支原體、衣原體檢出率亦顯著高于對(duì)照組。這在韓華等人的研究中得以證實(shí)［11］：CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組以及宮頸癌組的乳酸桿菌檢出率均顯著低于對(duì)照組。究其原因，解脲支原體是人乳頭瘤病毒促進(jìn)宮頸病變的重要輔助因子，和人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染以及宮頸早期細(xì)胞學(xué)改變存在密切相關(guān)。而衣原體的代謝產(chǎn)物可促使宮頸局部出現(xiàn)pH值的升高，進(jìn)一步對(duì)陰道局部免疫保護(hù)屏障造成破壞，繼而增加了人乳頭瘤病毒的易感性，最終促進(jìn)了宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展。正常而言，女性陰道菌群中主要以乳酸桿菌為主，其在保護(hù)女性陰道微生態(tài)平衡以及抑制病原微生物生長(zhǎng)，提高女性陰道局部抗感染以及抗腫瘤能力方面具有極其重要的作用。乳酸桿菌可保護(hù)女性陰道黏膜上皮細(xì)胞不會(huì)遭受病原菌侵害，同時(shí)分泌出相應(yīng)的物質(zhì)促進(jìn)生物膜的形成，繼而發(fā)揮抑制病原菌黏附和侵襲的作用。而隨著乳酸桿菌的下降，會(huì)導(dǎo)致女性陰道微生態(tài)平衡破壞，宮頸上皮對(duì)高危型人乳頭瘤病毒的易感性提高，從而促進(jìn)了宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展。IFN-γ主要是活化的Th細(xì)胞以及NK細(xì)胞合成、分泌，促進(jìn)Th1細(xì)胞的發(fā)育成熟，同時(shí)對(duì)Th2細(xì)胞的活化產(chǎn)生抑制作用，參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。IL-2則是機(jī)體免疫應(yīng)答核心因子之一，其活性高低和宮頸局部免疫狀態(tài)直接相關(guān)，隨著IL-2表達(dá)的增多可提高巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性。而IL-4主要是由激活的Th2細(xì)胞分泌，可促使Th細(xì)胞朝著Th2細(xì)胞方面分化，具有抑制殺傷細(xì)胞激活的功能［12］。而該文結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組血清IL-2水平均顯著低于對(duì)照組，IL-4水平顯著高于對(duì)照組，且CINⅡ組、CINⅢ組血清IFN-γ水平顯著低于對(duì)照組（均 P＜0.05）。 這提示了炎性因子 IFN-γ、IL-2 以及IL-4可能是宮頸癌前病變的影響因子，可能通過(guò)參與宮頸癌前病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［13-15］。

綜上所述，不同程度宮頸癌前病變的患者陰道菌群多樣性以及類型均和健康女性差異不大，僅CINⅠ患者的陰道部分菌群豐度增加。而解脲支原體、衣原體增加與乳酸桿菌減少以及血清IFN-γ、IL-2、IL-4水平異常改變，可能在宮頸癌前病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。