重度子癇前期胎盤組織中miR-210及GPD1L的相關(guān)性分析

付 晗，崔世紅，劉 靈，職云曉，陳 娟，呂曉峰，劉金金，閆書君

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重的PE對孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的健康產(chǎn)生極大的威脅，但其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。胎盤損傷是子癇前期發(fā)病的根源，其中胎盤缺血缺氧是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。近年大量研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）在低氧狀態(tài)下影響子宮螺旋小動脈的形成及滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化和侵襲能力，參與子癇前期的發(fā)病機(jī)制過程。

microRNAs（miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的在真核細(xì)胞中廣泛存在的非編碼單鏈小分子RNA家族，通過對靶mRNA的3’非翻譯區(qū) （3’untranslated region，3’UTR）互補(bǔ)配對結(jié)合抑制靶mRNA的表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［2］。研究表明，作為細(xì)胞在缺氧條件下特異性表達(dá)上調(diào)最顯著的miRNA分子miR-210在子癇前期胎盤中存在著明顯的表達(dá)上調(diào)，但其在PE中的發(fā)病機(jī)制尚在進(jìn)一步研究探索階段［3］。在腫瘤等低氧性疾病中證實(shí)［4］，甘油三磷酸脫氫酶-1-Like基因 （GPD1LmRNA）存在與miR-210靶向結(jié)合的3，UTR，受其靶向調(diào)控抑制，而GPD1L蛋白可以通過調(diào)節(jié)和維持脯氨酸氧化酶（PHD）的穩(wěn)定性增強(qiáng)其羥化HIF-1的能力而促進(jìn)HIF-1降解。但是在低氧條件下GPD1LmRNA的表達(dá)能力及GPD1L蛋白的調(diào)節(jié)能力受到抑制。這種調(diào)節(jié)機(jī)制在重度子癇前期（sPE）胎盤中是否發(fā)揮同樣的作用尚未見明確報(bào)道。因此該研究將著重分析miR-210、GPD1L及HIF-1α在重度子癇前期胎盤組織中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2018年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院并行剖宮產(chǎn)分娩的40例重度子癇前期孕婦為試驗(yàn)組及40例年齡相差2歲以內(nèi)產(chǎn)前檢查正常并行剖宮產(chǎn)分娩的健康孕婦為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有孕產(chǎn)婦均為中國漢族、單胎妊娠；對照組剖宮產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)：胎位異常、骨盆先天發(fā)育異常等無法經(jīng)陰道分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重炎癥、自身免疫性疾病、慢性高血壓、子癇前期病史、糖尿病、甲狀腺疾病及慢性肝腎疾病病史等。重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第九版［5］；該研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑 HIF-1抗體：武漢三鷹（Cat.No.20960-1-AP）、GPD1L 抗體：成都正能（Cat.No.611326）、SP染色試劑盒：中杉金橋 （Cat.No.SP-9000）、All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia （Cat.No.QP013）、All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit：GeneCopoeia （Cat.No.QP010）、All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit：Gene Copoeia （Cat.No.QP006）、All-in-OneTMqPCR Mix：GeneCopoeia（Cat.No.QP001）

1.3 方法 胎盤娩出5 min內(nèi)，立即在母體面四個象限的中央部位各取1塊約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤組織（所取標(biāo)本避免出血、梗死及鈣化灶等異常組織）用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗。取其中任兩塊組織放入10%甲醛中固定48 h以上送病理科進(jìn)行石蠟包埋并編號。另兩塊放入編號的滅菌EP管中在液氮中凍存24 h后放入-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.1 免疫組化法檢測胎盤組織中HIF-1蛋白及GPD1L蛋白的表達(dá)情況及其結(jié)果的判讀 石蠟包埋的標(biāo)本切制成5μm厚的連續(xù)切片，然后逐一脫蠟、水化，封閉、抗原高溫修復(fù)、分別滴加HIF抗體（稀釋度 1∶100）及 GPD1L 抗體（稀釋度 1∶200），隨后加入生物素標(biāo)記的二抗，0.04%DAB-H2O2顯色，經(jīng)蘇木精一伊紅染色（HE）染色，無水乙醇梯度脫水，中性樹膠固定。以PBS代替一抗做陰性對照，用于驗(yàn)證陽性切片為陽性對照。各步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。采用光學(xué)顯微鏡（400倍）下判斷切片質(zhì)量并進(jìn)行評分，然后采用鏈霉卵白素一生物素法檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。請兩名對患者臨床情況一無所知的副高以上的病理科醫(yī)師觀察免疫組化染色后的組織并評分。陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)胞漿染色情況和陽性細(xì)胞數(shù)來判定蛋白的表達(dá)水平。先按染色強(qiáng)度打分：無色-0分，淺黃色-1分，棕黃色-2分，棕褐色-3分；再按陽性細(xì)胞百分比打分：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為 2分，>50%～75%為 3分，>75%為4分；以上兩結(jié)果相加為最后得分：染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽性細(xì)胞百分比≥2分為陽性，染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽性細(xì)胞百分比<2分為陰性。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）法檢測胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1mRNA的表達(dá)水平 取適量胎盤組織樣本放于Trizol中研磨后提取總RNA，然后氯仿萃取、異丙醇沉淀、75%的乙醇洗滌、干燥RNA沉淀后用DEPC處理水溶解RNA沉淀，最后測RNA濃度和純度。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增引物由華大基因合成。陰性對照用水代替cDNA。miR-210的上游引物：5，-GGAGATCTGACCAGGTCATTTGCATAC-3’，下 游引物：5’-GGCCAACCGCGAGAAGATGTTTTTTTTT-3’；GPD1LmRNA 的上游引物：5’-TCGTTAGTTGTC

AGAATA-3’，下游引物：5’-TGTTAATCAGAAGAA TGTG-3’；HIF-1αmRNA 的上游引物：5’-CCGAGG AAGAACTATGAA-3’，下游引物：5’-GTTGGTTACT GTTGGTATC-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，GAPDH 的上游引物：5’-CTCTGGTAA AGTGGATATTGT-3’， 下游引物：5’-GGTGGAAT CATATTGGAACA-3’。擴(kuò)張反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 30 s，58℃退火，72℃延伸 30 s，40個循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果獲得到每個樣本中檢測基因的 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（x±s），組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 兩組孕婦的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；孕周、收縮壓及舒張壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 兩組胎盤組織中HIF-1及GPD1L蛋白的表達(dá)水平 與對照組相比，重度子癇前期胎盤組織中GPD1L 蛋白低表達(dá)，陽性率（32.5%，P＜0.05），HIF-1蛋白高表達(dá)，陽性率（65%，P＜0.05），見表 2 及圖 1、2。

表1 兩組孕婦一般情況比較（x±s）

表2 兩組胎盤組織中HIF-1蛋白的表達(dá)比較［例（%）］

下圖1、2：付 晗，崔世紅，劉 靈，等.重度子癇前期胎盤組織中miR-210及GPD1L的相關(guān)性分析（正文297～300，306頁）

圖1 各組胎盤組織中GPD1L蛋白的表達(dá)（×400倍）

圖2 各組胎盤組織中HIF-1蛋白的表達(dá)（×400倍）

2.3 兩組胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及

HIF-1mRNA的表達(dá)水平 重度子癇前期胎盤組織中miR-210及HIF-1mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組；而GPD1L mRNA的表達(dá)量明顯低于對照組（P值均＜0.001），見表3。重度子癇前期胎盤組織中miR-210的表達(dá)水平與GPD1L mRNA的表達(dá)水平存在明顯的負(fù)相關(guān)（r=-0.911，P＜0.001）。

3 討論

子癇前期是妊娠20周以后出現(xiàn)的以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的妊娠期特發(fā)性疾病，嚴(yán)重威脅母嬰生命健康。目前普遍認(rèn)為，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力受損及子宮螺旋小動脈重鑄不足導(dǎo)致胎盤缺血缺氧是導(dǎo)致子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。

HIF-1是由HIF-1及HIF-1β組成的一個異源性二聚體，其中HIF-1具有啟動基因表達(dá)活性的能力，受氧濃度的調(diào)節(jié)，參與機(jī)體的缺氧應(yīng)答反應(yīng)［7］。大量研究證實(shí)，HIF-1參與子癇前期相關(guān)的低氧反應(yīng)基因表達(dá)調(diào)節(jié)，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（sFlt-1）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β3）、胎盤生長因子 （PIGF）、腫瘤壞死因子、胰島素生長因子（IGF-1）、內(nèi)皮素-1（ET-1）及糖酵解有關(guān)的酶等，進(jìn)而影響子癇前期胎盤新生血管的形成及滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與分化能力［8-10］。該研究結(jié)果顯示：HIF-1mRNA在重度子癇前期胎盤組織中高表達(dá)且HIF-1蛋白表達(dá)的強(qiáng)陽性率明顯高于對照組。

GPD1L基因位于3p22.3染色體上，其編碼的蛋白參與能量的產(chǎn)生、滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞的生長發(fā)育及凋亡等生物學(xué)過程［11，12］。 研究證實(shí)［4，13］，PHD 在正常氧分壓條件下羥化HIF-1亞基上的氧依賴降解區(qū) （oxygen dependent degradation domain，ODD）的脯氨酸，羥化后HIF-1易與腫瘤抑制蛋白（von hoppel-lindauprontein，pVHL）結(jié)合進(jìn)而被泛素依賴的蛋白水解酶復(fù)合體酶解。缺氧時(shí)，PHD的表達(dá)被抑制，使得HIF-1無法被羥化降解而大量聚集，則累積的HIF-1與穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β結(jié)合形成HIF-1進(jìn)入細(xì)胞核啟動細(xì)胞內(nèi)下游缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，在重度子癇前期患者胎盤組織中GPD1LmRNA低表達(dá)且GPD1L蛋白的陽性率明顯降低，而HIF-1蛋白表達(dá)的陽性率明顯增加?？梢奌IF-1蛋白的累積可能同時(shí)表現(xiàn)在降解途徑被抑制及表達(dá)途徑增強(qiáng)，由此可以推測GPD1L蛋白在胎盤中可能同樣發(fā)揮維持PHD穩(wěn)定性的作用進(jìn)而調(diào)節(jié)HIF-1的含量。

表3 兩組胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1RNA的表達(dá)比較

miRNAs家族具有廣泛的基因調(diào)節(jié)能力，參與多種信號調(diào)節(jié)通路而發(fā)揮其生物學(xué)作用。目前已有大量研究表明，miR-210在缺氧條件下表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)而參與新生血管形成、線粒體的新陳代謝、細(xì)胞的增殖和DNA損傷修復(fù)能力等，從而參與疾病發(fā)病過程［14］，但在子癇前期重度研究尚處于起始階段。研究證實(shí)，在子癇前胎盤組織中基因同源型 A9（HOXA9）、碟素 A3（ephrin3，EFNA3）及 KCMF 基因受 miR-210 靶向調(diào)控參與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、血管重鑄及滋養(yǎng)細(xì)胞線粒體的能量代謝等［15，16］。該研究結(jié)果顯示：miR-210在sPE中表達(dá)明顯上調(diào)，提示胎盤處于缺氧狀態(tài)及miR-210可能通過調(diào)控下游基因的表達(dá)參與重度子癇前期的低氧應(yīng)答調(diào)節(jié)；此外miR-210表達(dá)水平與 GPD1LmRNA表達(dá)水平存在明顯的負(fù)相關(guān)，提示GPD1LmRNA在重度子癇前期胎盤中可能是miR-210的靶基因并受其靶向抑制。

綜上所述，miR-210與GPD1LmRNA的表達(dá)水平存在明顯的負(fù)相關(guān)，GPD1L蛋白的表達(dá)與HIF-1蛋白的表達(dá)水平明顯相反。因此推測miR-210可能通過抑制GPD1LmRNA的表達(dá)上調(diào)HIF-1蛋白的濃度而參與重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制過程。目前對于miRNA在子癇前期中的研究尚處于探索階段，此研究結(jié)果可能為其在子癇前期的研究提供一個新的思路。