姜黃素通過活化SIRT1拮抗CCl4誘導的小鼠肝臟纖維化

申昌軍 張帥 李浩鵬

[摘要] 目的 探討沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）在四氯化碳（CCl4）致小鼠肝纖維化肝臟中的活性變化及姜黃素對肝纖維化的干預作用與分子機制。 方法 選取C57BL/6小鼠24只，隨機分為正常組、模型組和姜黃素治療組，每組8只。腹腔注射CCl4制備肝纖維化模型，建模后姜黃素治療組給予0.5%羧甲基纖維素鈉姜黃素懸液灌胃;模型組及正常組給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，6周后處死小鼠。HE染色檢測小鼠肝臟病理變化情況;檢測各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、SIRT1活性;轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（CollⅠ）mRNA表達，及Cleaved-caspase3、CollⅠ蛋白表達情況。 結(jié)果 模型組血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α的表達量均顯著高于正常組（均P < 0.01），而治療組血清ALT、AST、IL-6、TNF-α表達量均低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）;模型組肝臟組織細胞中SIRT1的酶活性低于正常組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。治療組SIRT1的酶活性明顯高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。模型組肝臟組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA表達及CollⅠ表達量顯著高于正常組，Cleaved-caspase3顯著低于正常組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01），治療組TGF-β1、α-SMA的mRNA表達及CollⅠ表達量低于模型組，Cleaved-caspase3顯著高于模型組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。 結(jié)論 姜黃素對CCl4誘導的肝纖維化具有抑制作用，其機制可能是通過上調(diào)SIRT1活性，減輕炎性反應，抑制肝星狀細胞的活化，拮抗肝臟纖維化。

[關(guān)鍵詞] 肝臟;纖維化;姜黃素;炎性反應;沉默信息調(diào)節(jié)因子1

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（c）-0011-05

[Abstract] Objctive To investigate the activity of silencing information regulator 1 （SIRT1） in the liver of carbon tetrachloride （CCl4） induced liver fibrosis in mice， and to investigate the effect of curcumin on liver fibrosis and its molecular mechanism. Methods Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group， model group and Curcumin treatment group， with 8 mice in each group. Hepatic fibrosis model was prepared by intraperitoneal injection of CCl4. After the modeling， the curcumin treatment group was given 0.5% Carboxymethyl Cellulose Sodium Curcumin Suspension by gavage. The model group and the normal group were given 0.5% Sodium Carboxymethyl Cellulose by gavage， the mice were killed after 6 weeks. HE staining was used to detect the pathological changes of mouse liver. The levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and activity of SIRT1 were detected. Transforming growth factor β1 （TGF -β1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， collagen typeⅠ （Coll Ⅰ） mRNA expression， and Cleaved - caspase3， Coll Ⅰ protein expression. Results The expression levels of ALT， AST， IL-6 and TNF-α in serum of the model group were all significant higher than those of the normal group （all P < 0.01）. The expression levels of ALT， AST， IL-6 and TNF-α in the treatment group were all lower than those in the model group， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The enzyme activity of SIRT1 in the liver cells of the model group was lower than that of the normal group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The enzyme activity of SIRT1 in the treatment group was significantly higher than that in the model group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Model group in the liver tissue， TGF-β1， α-SMA mRNA and Coll Ⅰ expression of amount of expression were significantly higher than those of normal group， Cleaved-caspase3 was significantly lower than that of normal group， with highly statistically significant differences （all P < 0.01）. The mRNA expression of TGF-β1， α-SMA and Coll Ⅰ expression quantity in the treatment group were lower than those in the model group， Cleaved-caspase3 was significantly higher than that of model group， with highly statistically significant differences （all P < 0.01）. Conclusion Curcumin has an inhibitory effect on CCl4-induced liver fibrosis， and the mechanism may be to up-regulate the activity of SIRT1， thereby reducing the inflammatory response， inhibiting the activation of hepatic stellate cells， and antagonizing liver fibrosis.

[Key words] Liver; Fibrosis; Curcumin; Inflammation; Silencing information regulator 1

酒精性肝病、慢性肝炎、自身免疫性肝病等多種慢性肝病，往往導致肝纖維化病變。針對肝纖維化，目前臨床上尚無特異性治療方法阻斷甚至逆轉(zhuǎn)疾病進程。因此，預防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化仍然是眾多肝臟疾病研究的熱點及攻克的主要目標。姜黃素是姜黃根莖中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種藥理活性[1]。近年來，姜黃素的拮抗纖維化作用日益受到人們的關(guān)注，但其拮抗纖維化的分子機制仍不清楚。本研究擬在已有研究的基礎上，通過CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型，明確姜黃素抑制肝纖維化的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器來源

SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，6～8周齡，體重18～20 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心（合格證號：SYXK（軍）2012-0022）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號：h052）、白細胞介素-6（IL-6）（貨號：H007）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（貨號：C009-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（貨號：C010-2-1）均從南京建成生物工程研究所購買。姜黃素（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20050102）;SYBR Green MasterMix（美國應用生物系統(tǒng)公司，批號：A8605），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：AHF1813A），7900HT型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 動物分組及模型制備

C57BL/6小鼠采用22～26℃、SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，光照控制12 h明暗交替，濕度50%～60%。24只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、姜黃素治療組，每組8只（動物倫理批準號：XJYYLL-201805023）。模型組、姜黃素治療組小鼠按10 mL/kg給予腹腔注射10% CCl4的油劑溶液（CCl4∶橄欖油為1∶3～4次/周），經(jīng)病理切片證實肝纖維化模型建立成功。6周后姜黃素治療組采用姜黃素（劑量為40 mg/100 g）與0.5%羧甲基纖維素鈉混懸后按1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周;模型組自第7周起給予0.5%羧甲基纖維素鈉1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周;正常組，前6周給予腹腔橄欖油稀釋液，每周3次，第7周起給予0.5%羧甲基纖維素鈉1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周。灌胃6周后，取小鼠肝臟組織進行病理切片及對血清相關(guān)指標進行檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 形態(tài)學檢測? 取各組固定的組織標本，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟后HE染色，鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.2 血清學指標檢測? 小鼠眼球采血后，靜置15 min，4℃低溫離心（離心半徑15 cm，1500 r/min）15 min，分離血清，按試劑盒說明書測ALT、AST、IL-6、TNF-α水平。

1.3.3 酶活性試劑盒檢測肝臟組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）活性? 肝臟組織低溫裂解離心（4℃低溫離心，離心半徑15 cm，1500 r/min，15 min），收集上清。按照試劑盒說明書檢測SIRT1酶活性。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測肝臟組織中纖維化相關(guān)分子TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA的表達? 采用Trizol一步法提取肝臟組織中總RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR反應，引物序列分別為：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游5′-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3′，下游5′-TGGCGTAC-AGGTCTTTGCGG-3′;轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）上游5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′，下游5′-CT-GGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′;Ⅰ型膠原（CollⅠ）上游5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下游5′-AT-CCATCGGTCATGCTCTCT-3′;平滑肌肌動蛋白α-SMA上游5′-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3′，下游TCTATCGGATACTTCAGCGTCA-3′。擴增條件為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸20 s，循環(huán)40次，按照2-△△Ct的相對定量方法計算。

1.3.5 蛋白印跡法（Westen blot）檢測肝臟組織中Cleaved-caspase3、CollⅠ的表達? 肝臟組織，低溫組織勻漿，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入Cleaved-caspase3、Call Ⅰ一抗（1∶1000），4℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3000），37℃孵育40 min?；瘜W發(fā)光，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用兩樣本獨立樣本t檢驗（LSD-t檢驗）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟病理變化情況

HE染色顯示正常組（圖1A）鼠肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，小葉及匯管區(qū)無異常。而模型組（圖1B）小鼠注射CCl4后，光鏡下觀察到明顯的小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞腫脹，氣球樣變可見，明顯腫脹變形，伴點狀、片狀壞死及炎癥細胞浸潤，大量膠原沉積，在匯管區(qū)之間、匯管區(qū)與中央靜脈之間形成纖維間隔。治療組（圖1C）經(jīng)過干預后肝細胞輕度腫脹，細胞結(jié)構(gòu)清楚，膠原沉積量降低程度明顯。

A：正常組;B：模型組;C：治療組

2.2 三組小鼠血清中AST、ALT表達水平的比較

與正常組比較，模型組AST、ALT表達量明顯高于正常組，治療組AST、ALT表達量均低于模型組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 三組小鼠血清中IL-6、TNF-α表達水平的比較

模型組IL-6、TNF-α表達量均明顯高于正常組，治療組IL-6、TNF-α表達量均低于模型組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.4 三組小鼠肝臟細胞中SIRT1活性的比較

正常組小鼠SIRT1相對活性為（127.62±17.34）%，模型組為（64.80±7.25）%，治療組為（104.72±11.14）%，三組比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 17.36，P = 0.012）。模型組小鼠SIRT1相對活性明顯低于正常組（t = 13.57，P < 0.01）;治療組小鼠SIRT1相對活性明顯高于模型組（t = 6.54，P = 0.001）。

2.5 三組小鼠肝臟組織纖維化相關(guān)分子TGF-β1、CollⅠ、α-SMA表達及Cleaved-caspase3、CollⅠ相關(guān)蛋白表達的比較模型組中TGF-β1、α-SMA、CollⅠ的mRNA及CollⅠ蛋白表達明顯高于正常組;治療組TGF-β1、α-SMA、Coll Ⅰ的mRNA及Coll Ⅰ蛋白表達明顯低于模型組，模型組小鼠肝臟中Cleaved-caspase3的表達低于正常組，而治療組Cleaved-caspase3的表達高于模型組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。見表3～4、圖2。

3 討論

損傷后的肝臟在各種刺激下，肝臟內(nèi)細胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生和降解失衡，導致過度增生與異常沉積，使肝臟結(jié)構(gòu)破壞、功能異常，從而導致肝臟纖維化[2]。目前肝纖維化治療主要是通過抗病因治療，尚無特效的藥物治療。

臨床上無論是肝臟損傷、病毒感染、藥物作用、自身免疫等因素最終都會經(jīng)過肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化發(fā)展成纖維化[3]。當肝臟受到損傷后直接或間接激活HSC，使其由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，導致大量ECM的形成。IL-6、TNF-α等促炎介質(zhì)能通過介導炎性反應啟動纖維化的形成，并可通過促進ECM的合成而促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。已有研究顯示，TGF-β1能夠刺激ECM合成，抑制其降解，是最強促纖維化細胞因子[5]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，正常組TNF-α、IL-6、TGF-β1表達均明顯增多，而治療組可顯著降低TNF-α、IL-6、TGF-β1的表達。

此外，HSC的活化可促進ECM的大量表達，在此過程中纖維化相關(guān)因子α-SMA的生成被認為是HSC活化的主要標志物[6]，而CollⅠ是ECM的主要成分，產(chǎn)生大量的CollⅠ是纖維化疾病的共同病理特征。Inagaki等[7]研究顯示，抑制CCL4誘導的肝纖維化大鼠體內(nèi)CollⅠ的表達，可減輕ECM的過度增生。在本研究中，與模型組比較，治療組可降低ALT、AST活性，減少致纖維化因子α-SMA，CollⅠ的表達。通過模型驗證，治療組顯示出良好的拮抗肝損傷和阻止纖維化的功能，且可能通過抑制HSC的活化發(fā)揮作用。

有研究報道[8-10]，SIRT1在多種疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Cappetta等[11]發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1可通過下調(diào)TGF-β/smad3信號通路發(fā)揮抗心肌纖維化實現(xiàn)。本研究檢測了姜黃素對SIRT1活性表達的影響。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組SIRT1的酶活性顯著下調(diào)。而治療組可顯著改善CCl4介導的肝臟組織細胞SIRT1的酶活性水平。提示SIRT1信號分子可能參與姜黃素對肝臟纖維化的拮抗作用。

目前研究顯示，在不同器官中，姜黃素拮抗纖維化可能有多種途徑，與細胞的氧化應激、炎性反應等密切相關(guān)[12-14]。而SIRT1是生物體內(nèi)具有重要意義的去乙?；?。研究顯示，SIRT1可調(diào)控肝臟疾病的多個環(huán)節(jié)[15]。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制腫瘤進展[16]。此外，SIRT1可顯著抑制高脂飲食導致的肝損傷[17-19]。而脂肪肝、肝纖維化、肝癌本身可能是相互轉(zhuǎn)化[20-21]。本研究顯示，姜黃素可能通過調(diào)控SIRT1進而抑制HSC的活化拮抗肝纖維化。姜黃素可以在肝臟病變的多個環(huán)節(jié)影響疾病的進展、改善結(jié)局。因此，深入研究姜黃素-SIRT1調(diào)節(jié)軸的作用機制，發(fā)現(xiàn)多種肝臟疾病的共同調(diào)控通路，可以為臨床治療提供新的思路。

綜上所述，姜黃素可通過抑制HSC的活化拮抗CCl4介導的肝臟纖維化，在此過程中可能通過增加SIRT1的酶活性發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2019-09-30? 本文編輯：封? ?華）