20 307例黎族新生兒多種遺傳代謝性疾病篩查研究

趙振東，王潔

遺傳代謝性疾病又稱為先天性代謝缺陷疾?。↖EM），是指由于基因突變引起酶缺陷、細(xì)胞膜功能異常或受體缺陷，從而導(dǎo)致機(jī)體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組疾?。?］。目前發(fā)現(xiàn)已有1 000多種，盡管遺傳代謝性疾病單一病種發(fā)病率低，但因其疾病種類多，國外有數(shù)據(jù)表明，其綜合發(fā)病率為1/2 555～1/784［2-4］，平均約為1/1 000［5］，累計(jì)發(fā)病率高。本研究借助海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目的研發(fā)以及中國出生缺陷基金會(huì)2017年8月在海南省開展多種遺傳代謝性疾病免費(fèi)篩查項(xiàng)目的實(shí)施，將20 307例黎族新生兒干血片樣本進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法篩查遺傳代謝性疾病，從而在黎族人群中防治遺傳代謝性疾病等出生缺陷性疾病，同時(shí)建立黎族生物樣本庫，現(xiàn)將篩查結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集海南省2016年10月—2018年9月出生的黎族新生兒共計(jì)20 307例，其中男嬰10 254例，女嬰10 053例。新生兒出生滿3～28 d，采取知情同意原則，自愿參加免費(fèi)的多種遺傳代謝性疾病篩查。本研究經(jīng)過海南省婦幼保健院倫理審查，批準(zhǔn)號(hào)為海南省婦幼保健院（2018）倫審第（37）號(hào)。

1.2 樣本采集 按照《新生兒篩查采血技術(shù)規(guī)范》［6］要求，使用新生兒篩查采血卡，采集出生滿3～7 d，充分哺乳6～8次的新生兒足跟血。

1.3 樣本要求 血斑直徑≥8 mm，血斑數(shù)量3～4個(gè)，雙面滲透均勻。陰涼處水平晾干，密封于封口袋2～8 ℃冰箱保存，5 d內(nèi)新生兒篩查冷鏈系統(tǒng)送至海南省新生兒疾病篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮串聯(lián)質(zhì)譜法測定試劑盒（美國PE公司）、ACQUITYTM型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）、艾本森MicBio-Ⅳ型孵育振蕩器（合肥愛本森公司）、Vortex Mixer XW-80A混勻器（海門其林貝爾公司）以及打孔鉗（芬蘭PE公司，直徑3 mm）。

本研究價(jià)值和提示：

（1）本研究在黎族新生兒中進(jìn)行多種遺傳代謝性疾病的篩查，這在海南省尚屬首次。

（2）趙振東等在20 307例黎族新生兒群體中通過多種遺傳代謝性疾病的篩查，發(fā)現(xiàn)了12例患兒，主要有原發(fā)肉堿缺乏癥（PCD）、苯丙酮尿癥（PKU）、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（MCCD）、丙二酸血癥（MAD）和甲基丙二酸血癥（MMA）5類疾病，在有限的黎族新生兒群體中得到了黎族人群遺傳代謝性疾病發(fā)病率為59/10萬，發(fā)現(xiàn)黎族人群遺傳代謝性疾病發(fā)病率高。

1.5 方法

1.5.1 遺傳代謝性疾病串聯(lián)質(zhì)譜初篩 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在新生兒干血片樣本上，使用打孔鉗打下直徑為3 mm的血斑，使用試劑盒中配制試劑經(jīng)孵育萃取后，上串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測樣本中11種氨基酸、1種游離肉堿以及30種?；鈮A，分析濃度和比值共計(jì)78項(xiàng)指標(biāo)。

1.5.2 初篩遺傳代謝性疾病異常結(jié)果確認(rèn) 實(shí)驗(yàn)報(bào)告送至遺傳代謝性疾病專科醫(yī)生審核。根據(jù)“串聯(lián)質(zhì)譜擴(kuò)大新生兒疾病篩查鑒定代謝性疾病的后續(xù)檢測”召回和后續(xù)協(xié)議［7］，遺傳代謝性疾病?？漆t(yī)生根據(jù)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷。

1.5.3 遺傳代謝性疾病基因診斷 經(jīng)醫(yī)生判斷疑似遺傳代謝性疾病的樣本，召回重新采血外送北京邁基諾基因公司進(jìn)行測序進(jìn)行基因診斷。

2 結(jié)果

2.1 異常率 遺傳代謝性疾病?？漆t(yī)生根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜78項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)參考范圍和臨床癥狀進(jìn)行判斷初篩異常有840例，初篩異常率為4.14%（840/20 307）。隨訪死亡5例，召回835例，復(fù)查后排除770例，疑似遺傳代謝性疾病65例，召回異常率7.78%（65/835）。在65例疑似遺傳代謝性疾病病例中已確診遺傳代謝性疾病12例。其中疑似有機(jī)酸血癥28例，確診3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（MCCD）2例，甲基丙二酸血癥（MMA）1例，丙二酸血癥（MAD）1例；疑似氨基酸血癥19例，確診苯丙酮尿癥（PKU）3例；疑似脂肪酸血癥18例，確診原發(fā)肉堿缺乏癥（PCD）5例。海南省黎族新生兒多種遺傳代謝性疾病發(fā)病率為59/10萬（12/20 307）。詳見表1。

2.2 基因突變分析 在已確診的12例遺傳代謝性疾病患兒中，5例PCD發(fā)現(xiàn)了3種基因突變：1例c.760C＞T、2例c.51C＞G和2例c.338G＞A，其中4例男嬰、1例女嬰。3例PKU中發(fā)現(xiàn)了3種基因突變：c.1081A＞T、c.728G＞A和c.764T＞C，其中2例女嬰、1例男嬰。2例MCCD基因突變位點(diǎn)均為c.1331G＞A，且均為女嬰。1例MAD基因突變位點(diǎn)為c.541G＞A，患兒為女嬰。1例MMA基因突變位點(diǎn)為c.456delT，患兒為男嬰。部分基因測序圖詳見圖1。

3 討論

遺傳代謝性疾病是新生兒疾病篩查的重要內(nèi)容之一，國內(nèi)外專家一致認(rèn)為早期篩查并及時(shí)予以有效治療是確保新生兒健康成長的關(guān)鍵［8-10］。遺傳代謝性疾病對(duì)新生兒的身體發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育以及腦功能造成嚴(yán)重影響，是不可逆的損傷，甚至死亡［11-12］，不但給家庭帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且也會(huì)影響人口素質(zhì)。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因能夠篩查出有機(jī)酸代謝異常、氨基酸代謝異常和脂肪酸代謝異常等疾病，現(xiàn)在已是篩查遺傳代謝性疾病的主要手段［13］，在國外已經(jīng)將其應(yīng)用在新生兒的遺傳代謝性疾病篩查領(lǐng)域中［14］。本研究通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)海南省20 307例黎族新生兒進(jìn)行遺傳代謝性疾病篩查后，發(fā)現(xiàn)黎族新生兒遺傳代謝性疾病患病率高達(dá)4.14%，這為該地區(qū)遺傳代謝性疾病的診治提供了診斷方向。

表1 20 307例黎族新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查情況（例）Table 1 Screening results of 20 307 newborns of Li ethnic group by tandem mass spectrometry

圖1 部分確診遺傳代謝性疾病基因測序圖Figure 1 The gene sequencing graph of partial confirmed IEM patients

3.1 PCD發(fā)病率 據(jù)報(bào)道在正常人群中PCD的基因攜帶率很高，為0.5%～1.0%［15］，而本次確診了5例PCD，1例 c.760C＞T、2例c.51C＞G 和 2例 c.338G＞A，黎族新生兒遺傳代謝性疾病以PCD居多。PCD的致病基因?yàn)镾LC22A5，定位在染色體5q31.1，有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。從遺傳規(guī)律來講，本病應(yīng)該是男女患病概率相等，有報(bào)道女性發(fā)病多于男性［16］，是因?yàn)槿焉锏葢?yīng)激反應(yīng)刺激所致。但本次確診黎族新生兒PCD中4例為男嬰，1例為女嬰，與已見報(bào)道相異。海南省地處祖國最南端，氣候有別于他地，當(dāng)?shù)厝松瞽h(huán)境和方式是否與PCD高發(fā)相關(guān)有待深入研究。本病存在地域和種族差異，各地域報(bào)道突變位點(diǎn)不同［17］：中國上海的突變位點(diǎn)P.R254X最高，高加索人群常見R282X，意大利人為R169W，東亞人群常見W132X和W283C，而海南省黎族新生兒確診3種突變位點(diǎn)：c.760C＞T、c.51C＞G 和c.338G＞A，其中 c.760C＞T和 c.51C＞G 是中國人群最常見突變［18］，而c.338G＞A是一種極為罕見的突變，該位點(diǎn)直到2017年［19］才被確認(rèn)。

海南省黎族絕大部分聚居地屬貧困地區(qū)，因交通不便、經(jīng)濟(jì)落后和民俗等原因，黎族種族血統(tǒng)較為純粹，近親婚配發(fā)生率高，造就了遺傳代謝性疾病PCD發(fā)生率增加，本次初步計(jì)算出黎族新生兒PCD發(fā)病率為1/4 061（5/20 307），與國內(nèi)上海2.4/10萬、浙江3.1/10萬［17］相比，均較高。中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（http：//www.nhc.gov.cn/）2009-06-01開始實(shí)施的《新生兒疾病篩查管理辦法》（原衛(wèi)生部令第64號(hào)）規(guī)定新生兒必須進(jìn)行PKU和先天性甲狀腺功能低下癥（CH）兩個(gè)病種的篩查，從海南省2007年開展新生兒篩查以來，筆者曾報(bào)道海南省PKU的發(fā)病率為1/34 362［20］，CH的發(fā)病率為1/3 230［21］，而本次少數(shù)民族地區(qū)海南省八市縣新生兒PCD發(fā)病率高于PKU，接近CH，況且PCD又是治療效果良好的疾病，因此有理由建議在海南省黎族人群開展PCD新生兒篩查。

3.2 PKU發(fā)病率 PKU是一種常見的常染色體隱性遺傳代謝病。該疾病主要引起智力障礙。《新生兒疾病篩查管理辦法》已經(jīng)規(guī)定PKU是新生兒疾病篩查的必篩病種，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)既可以檢測Phe和Tyr的濃度，又可以結(jié)合Phe/Tyr比值進(jìn)行判斷，更有利于PKU的早期發(fā)現(xiàn)與診斷。

在本次調(diào)查研究中，確診了3例PKU，并且檢 出 了 3種 基 因 突 變：c.1081A＞T、c.728G＞A 和c.764T＞C。c.1081A＞T屬 無 義 突 變， 美 國 醫(yī) 學(xué) 遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（ACMG）［22］定義為致病突變（PVS+PM2+PM3+PM5+PP4），PVS：該變異為零效變異（無義突變），可能導(dǎo)致基因功能喪失；PM2：在正常人群數(shù)據(jù)庫中的頻率為0.000 02，為低頻變異；PM3：隱性遺傳?。籔M5：相同位置的突變?cè)贖GMD數(shù)據(jù)庫已有報(bào)道但氨基酸變化不同；PP4：患者表型高度特異于單一遺傳基礎(chǔ)的疾病；目前HGMD數(shù)據(jù)庫未有該位點(diǎn)的相關(guān)性報(bào)道，經(jīng)家系驗(yàn)證分析患兒父親該位點(diǎn)雜合變異，母親該位點(diǎn)無變異。生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen_2、REVEL分別預(yù)測為未知、未知、未知。

L255S突變目前在國內(nèi)報(bào)道2例，1例出現(xiàn)在北方，1例出現(xiàn)在河南［23］，海南黎族人群此次檢出屬第3次，說明L255S屬于較少見的突變類型，而且從北方人群到南方人群均存在。另1例p.R243Q位于7號(hào)外顯子突變，這也是我國北方人群常見突變類型。

3.3 MCCD、MMA和MAD發(fā)病率 在20 307例新生兒當(dāng)中篩查疑似有機(jī)酸血癥28例，高于疑似氨基酸血癥19例和脂肪酸血癥18例，有機(jī)酸血癥患病率高達(dá)1/725（28/20 307），說明黎族新生兒有機(jī)酸血癥患病率高。目前確診了4例，分別是MCCD 2例、MMA 1例和MAD 1例。MCCD是一種常染色體隱性疾病，目前海南省20 307例黎族新生兒確診了2例MCCD，因存在著偶然性，需要累積足夠大的樣本量再計(jì)算MCCD的發(fā)病率。MMA也是一種常染色體隱性遺傳病，主要是由于甲基丙二酸輔酶A變位酶自身缺陷或其輔酶鈷胺素（cobalamin，cb1，維生素B12）代謝缺陷，導(dǎo)致甲基丙二酸、3-羥基丙酸及甲基枸櫞酸等代謝產(chǎn)物異常蓄積，引起腦、肝、腎、骨髓及心臟等多種臟器損傷，造成認(rèn)知和行為改變的疾病?；蝾愋涂煞譃椋篶b1A、cb1B、cb1C和cb1D，其中cb1C是常見類型，而本次確診MMA為cb1A型。MAD也稱丙二酸尿癥，是一種極罕見的有機(jī)酸血癥，該疾病是常染色體隱性遺傳病，全世界目前報(bào)道僅為30例［18］，主要造成新生兒生長發(fā)育遲緩和精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙。本次確診1例屬海南省的首次報(bào)道。

MCCD主要是由于MCCC1和MCCC2基因突變所致，本次確診2例MCCD均為MCCC1型，定位于3q27.1。c.1331G＞A突變導(dǎo)致氨基酸改變致P.R444H（第4444號(hào)由精氨酸變異成組氨酸），屬錯(cuò)義突變，該變異不屬于多態(tài)性位點(diǎn)，在人群中發(fā)生率極低，HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫已報(bào)道其與3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥相關(guān)，與CARROLL等［24］報(bào)道相同。

MMA定位在7號(hào)外顯子4q31.1-q31.2。c.456delT（缺失）導(dǎo)致氨基酸改變p.G153Vfs*8（移碼突變）。該變異在正常人群數(shù)據(jù)庫頻率為未知。蛋白功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預(yù)測結(jié)果分別為未知、未知、未知。在HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，受檢人之父該位點(diǎn)無變異，受檢人之母該位點(diǎn)雜合變異。

MAD致病基因位于16q24的MLYCD基因，本次經(jīng)基因測序后發(fā)現(xiàn)患兒為純合突變。c.541G＞A（編碼區(qū)第541號(hào)核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤），導(dǎo)致氨基酸改變p.V181M（第181號(hào)氨基酸由纈氨酸變異為甲硫氨酸），為錯(cuò)義突變。根據(jù)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南［25］，該變異初步判定為臨床意義未明。HGMD數(shù)據(jù)庫未有該位點(diǎn)的相關(guān)性報(bào)道；經(jīng)家系驗(yàn)證分析，父親該位點(diǎn)雜合變異，母親該位點(diǎn)純合變異；在正常人群數(shù)據(jù)庫中的頻率為0.014 00。

對(duì)篩查方案的成本效益評(píng)估高度敏感的一個(gè)重要因素是疾病的發(fā)病率［24］，因?yàn)檫z傳代謝性疾病在不同種族之間存在差異。盡管本次樣本量較少，但從本研究結(jié)果可以看出從20 307例新生兒中確診12例遺傳代謝性疾病，初步計(jì)算出海南省黎族新生兒多種遺傳代謝性疾病發(fā)病率為59/10萬，相比歐洲人群發(fā)病率29.51/10萬高［26］。據(jù)研究遺傳代謝性疾病在亞洲人群的發(fā)生率為16.08/10萬～26.35/10萬［27］，海南省黎族人群遺傳代謝性疾病發(fā)病率屬高人群。由此認(rèn)為在海南省黎族人群中進(jìn)行遺傳代謝性疾病的篩查是有意義的。

作者貢獻(xiàn)：趙振東、王潔進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，結(jié)果的分析與解釋，論文的修訂；趙振東進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫論文；王潔負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。