通絡(luò)外洗液有效成分二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量測定

張艷霞 羅瑜 李學(xué)明 張遠華

[摘要]目的 探討通絡(luò)外洗液中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量測定方法，以控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）測定通絡(luò)外洗液中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量，色譜洗脫柱為Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水（58∶42）;流速：1 ml/min;檢測波長：330 nm;柱溫：35℃;進樣量：5 μl。結(jié)果 二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在44.45～889.00 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.9998）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<2.00%，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的回收率平均值為98.50%（RSD=1.79%，n=6），通絡(luò)外洗液制劑中的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量不得低于0.20 mg/ml。結(jié)論 采用HPLC測定通絡(luò)外洗液有效成分二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量取得良好的質(zhì)量測評效果。

[關(guān)鍵詞]通絡(luò)外洗液;二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯;高效液相色譜法;含量測定

[中圖分類號] R284? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）3（a）-0032-04

Determination of the content of dihydroparsley angelic acid ester as an active ingredient in Tongluo External Lotion

ZHANG Yan-xia? ?LUO Yu? ?LI Xue-ming? ?ZHANG Yuan-hua

Department of Pharmacy， Shaoguan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province， Shaoguan? ?512026， China

[Abstract] Objective To study a method for the determination of dihydroparsin angelic acid ester in Tongluo External Lotion， so as to control the intrinsic quality of the preparation. Methods The content of dihydroparsin angelic acid ester in the washing solution was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The chromatographic elution column was Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; mobile phase： acetonitrile-water （58∶42）; flow rate： 1 ml per minute; detection wavelength： 330 nm; column temperature： 35℃; injection amount： 5 μl. Results Dihydroparsin angelic acid ester had a good linear relationship in the range of 44.45-889.00 μg/ml （r=0.9998）. The relative standard deviation （RSD） of precision， repeatability and stability test results were all <2.00%， the average recovery rate of dihydroparsin angelic acid ester as angelic acid ester was 98.50% （RSD=1.79%， n=6）， and the content of dihydroparsin angelic acid ester in the Tongluo External Lotion preparation should not be less than 0.20 mg/ml. Conclusion HPLC is used to determine the content of dihydroparsin as an active ingredient in Tongluo External Lotion.

[Key words] Tongluo External Lotion; Dihydroparsin angelic acid ester; High performance liquid chromatography; Content determination

通絡(luò)外洗液為我院骨科專家研制的用于骨折、扭挫傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)腫脹疼痛等的純中藥制劑，并已取得醫(yī)院制劑批文（粵ZB20110531）。該制劑由獨活、香加皮、艾葉、桂枝、花椒根、鉤藤、雞血藤、豆豉姜共8味中藥組成，具有活血通絡(luò)、消腫止痹痛的功效，經(jīng)臨床廣泛應(yīng)用，收到滿意的療效，且使用簡便、藥源豐富、安全性高，已深受患者的歡迎。在此之前，該制劑的質(zhì)量控制僅限于對獨活的薄層定性鑒別和微生物檢測，無有效成分的含量測定項目。為使通絡(luò)外洗液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控性更強，更好地發(fā)揮其臨床療效，本研究以獨活所含的主要成分之一二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯為測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）對其進行含量測定研究，為提高通絡(luò)外洗液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)。關(guān)于HPLC測定中成藥中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量鮮有報道，本文在參考中國藥典及相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，進行系列的色譜條件試驗，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器與試劑

KQ5200DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏儀器有限公司）; Agilent1100，Sartorius SQP型（日本島津）;十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，max 60 g，d 0.01 mg）;乙腈、甲醇（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?本研究所用試劑均為分析純;水為自制蒸餾水。

1.2試藥

通絡(luò)外洗液（本院制劑室提供，批號：20190512、20190513、20190514，每包250 ml）;獨活陰性對照樣品（本院制劑室提供，批號：20190512、20190513、20190514，每包250 ml）;二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號：050006-201811，HPLC≥98%）。

2方法與結(jié)果

2.1通絡(luò)外洗液的制備

取60份處方中的8味藥材，稱取總重量，置煎煮提取器中加入藥材總重的12倍水，充分浸泡（夏季提前2 h浸泡，冬季需浸泡過夜），加熱煎煮提取2次，頭煎2 h，二次煎1.5 h，合并兩次煎液，常壓濃縮至30 000 ml，相對密度不低于1.01（25℃），分裝，即得。

2.2 制劑的性狀

本品為棕黑色液體，氣微香。

2.3二氫歐芹當(dāng)歸酸酯的含量測定

2.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水（58∶42）;流速：1.0 ml/min;檢測波長：330 nm;柱溫：35℃;進樣量：5 μl。理論塔板數(shù)按二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯≥6000。

2.3.2溶液的制備

2.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備? 精密稱取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品8.89 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解后，稀釋至刻度，定容、搖勻，配成濃度為0.889 mg/ml的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品溶液。

2.3.2.2供試品溶液的制備? 精密量取通絡(luò)制劑50 ml，加入95%乙醇60 ml靜置沉淀48 h，抽取上清液，置水浴鍋80℃烘干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.3.2.3陰性空白對照溶液? 精密量取按處方比例及制備工藝制備不含獨活的陰性制劑50 ml，按照供試品溶液的制備方法制成陰性空白對照溶液，備用。

2.3.3線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3.2.1”項下對照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別進樣5 μl，注入液相色譜儀，依照上述色譜條件，測定其峰面積積分值。以進樣量（μg/ml）為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸分析。計算回歸方程為Y =12.432X+25.854，R2=0.9999。結(jié)果顯示，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在44.45～889.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

2.3.4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各5 μl，按“2.3.1”項下的色譜條件，注入HPLC檢測儀，依法測定，并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中與二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯相對應(yīng)的保留時間處（T=18.075）有明顯的吸收峰，且呈現(xiàn)出與相鄰其他成分較理想的色譜分離度（R>1.5），而陰性空白對照液在二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯相應(yīng)保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，提示陰性樣品不存在干擾。色譜圖見圖2～4。

2.3.5穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（批號：20190512）5 μl，每隔一段時間進樣1次，測得樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，記錄色譜峰面積的RSD為1.03%。結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表1）。

2.3.6重復(fù)性試驗

取同一批次制劑供試品（批號：20190513），按上述供試品溶液的制備方法平行制備5份供實驗用的樣液，分別精密吸取5 μl，依法注入液相色譜儀，測定二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量，平均含量為0.261 mg/ml，計算RSD為1.96%，提示制劑的含量測定方法的重復(fù)性良好（表2）。

2.3.7精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液5 μl，連續(xù)依法進樣操作5次，記錄峰面積的RSD為0.20%，提示精密度良好（表3）。

2.4.7加樣回收率試驗

精密量取已知含量的同一批次供試品（批號：20190513，含量為0.258 mg/ml）25 ml，平行做6個，分別精密加入2.2084 mg/ml的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品3 ml，按“1.3.2”項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取各加樣回收供試品溶液5 μl，注入液相色譜儀測定含量，試驗結(jié)果見表4。

2.4.8樣品含量測定

取3批樣品（批號：20190512、20190513、20190514），按供試品溶液的制備條件測定，每次進樣5 μl，計算含量及RSD值，測定結(jié)果見表5。

經(jīng)上述3批平均含量測定結(jié)果，在其平均含量的基礎(chǔ)上下浮20%，因此，暫定通絡(luò)外洗液制劑中的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量不得低于0.20 mg/ml。

3討論

通絡(luò)外洗液屬于我院的院內(nèi)制劑，在臨床多年使用至今，療效確切，原先的質(zhì)量控制僅限于物理鑒別和獨活的薄層定性鑒別，而HPLC測定有效成分的含量是最能有效控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，同時也是制劑穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)。獨活作為通絡(luò)外洗方中的君藥，具有祛風(fēng)通痹止痛的功效，在臨床療效中發(fā)揮關(guān)鍵作用。二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯為獨活中的主要成分之一，本研究選取獨活中的有效成分二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯建立含量測定方法，并進行了方法學(xué)考察，旨在為提高通絡(luò)外洗液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使制劑的定量鑒別具有一定的代表性。