茶黃素雙沒食子酸酯的功能活性研究進(jìn)展

嚴(yán)佳丹，馮思敏

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

茶黃素呈橙色或桔紅色，具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)，是茶葉中的兒茶素類化合物在發(fā)酵加工過程中在多酚氧化酶的氧化作用下，氧化聚合形成的抗氧化劑多酚化合物。隨著發(fā)酵期的延長，它們的數(shù)量會(huì)不斷減少，茶黃素水平與紅茶品質(zhì)呈正相關(guān)[1-2]。紅茶中含有4個(gè)主要茶黃素：茶黃素(TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF2A)、茶黃素-3′-沒食子酸酯(TF2B)和茶黃素雙沒食子酸酯(TF3)。此外還有許多茶黃素衍生物，包括茶黃素酸和茶堿[3-5]。雖然茶黃素僅占沖泡紅茶固體干重的2%～6%[6-7]，但其對(duì)茶的顏色[8]、口感[9]和茶膏形成程度有很大的貢獻(xiàn)[10]。TF3含有2個(gè)沒食子酸基團(tuán)，沒食子酸基團(tuán)是某些物質(zhì)具有生理活性的必要條件[11-13]，這可能是TF3具有較其他茶黃素成分更強(qiáng)的生物活性的原因。

1 茶黃素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

紅茶中的黃酮類化合物中約30%為兒茶素，50%為茶紅素，10%為茶黃素[14]。在內(nèi)源多酚氧化酶和過氧化物酶的催化作用下，茶葉中的兒茶素極易與氧氣反應(yīng)被氧化成鄰醌，鄰醌會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，形成的中間產(chǎn)物聯(lián)苯酚醌類具有不穩(wěn)定性，極易進(jìn)行自身歧化作用，一部分被還原形成黃烷醇，另一部分被氧化縮合形成茶黃素[15]，產(chǎn)生4種主要茶黃素：茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃-3′-沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)為

Collier[3]對(duì)茶黃素的紅外光譜研究表明所有茶黃素的最大吸收峰都出現(xiàn)在380 nm和460 nm。茶黃素是橙黃色結(jié)晶狀粉末，熔點(diǎn)237～240 ℃，易溶于熱水、乙醇、丙酮、異丁基甲酮、正丁醇和醋酸乙酯[16]。茶黃素在堿性條件下不穩(wěn)定，在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下，茶黃素可促進(jìn)茶萘醌的形成[17]。茶黃素雙沒食子酸酯(TF3)是由表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)的多聚反應(yīng)形成[18]。

2 體內(nèi)代謝

2.1 體內(nèi)吸收機(jī)制

茶黃素的血漿半衰期約為1～3 h，與兒茶素半衰期相似或略短[19]。健康人體體外糞便培養(yǎng)和進(jìn)食研究獲得的數(shù)據(jù)表明茶黃素及其沒食子酸基衍生物在上消化道或下消化道中均未檢測到吸收量[20]。事實(shí)上，口服茶黃素的生物利用度非常低。即使人類志愿者口服非常高劑量的茶黃素后(700 mg，相當(dāng)于30杯紅茶)，血漿和尿液的峰值水平也僅僅分別為1.0 μg/L和4.2 μg/L[21]。Takeda等[22]通過液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測到茶黃素在人類腸道細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層中沒有顯著的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此可以考慮將茶黃素劃分到不易吸收的多酚中?；谶@些前人已有成果，筆者預(yù)計(jì)一杯茶中的茶黃素大部分仍保留在胃腸道的管腔中。

2.2 體內(nèi)代謝機(jī)制

Chen等[23]用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定TF3在雌性C57BL/6J大鼠糞便中的代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TF3在大鼠體內(nèi)可廣泛代謝，主要的代謝產(chǎn)物有4種，分別是TF1、TF2A、TF2B和沒食子酸，這些代謝產(chǎn)物最有可能是由腸道菌群產(chǎn)生的。葡萄糖醛酸化和硫酸化是TF3的次要生物酶形成途徑。為了驗(yàn)證微生物群是紅茶茶黃素代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的必要條件，隨后Chen等[24]做了另一個(gè)試驗(yàn)，用200 mg/kg的TF3灌胃特異性無病原體(SPF)小鼠和無菌(GF)小鼠，并確定TF1、TF2A、TF2B和沒食子酸是SPF小鼠TF3的主要糞便代謝物。這些代謝物在TF3灌胃GF小鼠中不存在。利用從3名健康人類身上采集的糞便泥漿，在體外研究了TF3，TF2A和TF2B的微生物轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明：TF3被人類微生物群代謝為TF1、TF2A、TF2B、沒食子酸和鄰苯三酚。此外，TF2A和TF2B都被人體微生物代謝為TF1、沒食子酸和鄰苯三酚。

3 TF3的功能活性

3.1 抗氧化性

Shiraki等[25]報(bào)道茶黃素的沒食子酸部分可能對(duì)它們有效的抗氧化活性至關(guān)重要；Jhoo等[17]提出了通過單電子氧化形成茶黃素和鄰苯二酚醌的自由基氧化機(jī)理，表明茶黃素的苯并三酚酮部分在為優(yōu)選的氧化位點(diǎn)提供抗氧化劑保護(hù)中起重要作用，由于存在共振形式，苯并三酚酮部分可能負(fù)責(zé)電子的提供；Jovanovic等[26]報(bào)道沒食子酸酯化茶黃素比沒有沒食子酸酯化的茶黃素具有更低的超氧化物清除活性，提出沒食子酸部分可以防止茶黃素中自由基和苯并對(duì)苯二酚酮部分之間的反應(yīng)。

3.1.1 抑制自由基的產(chǎn)生

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一種穩(wěn)定的自由基，廣泛應(yīng)用于樣品的抗氧化能力測定，羥基自由基會(huì)造成體內(nèi)脂質(zhì)過氧化而破壞細(xì)胞，因此樣品對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除能力可以反映樣品的抗氧化能力[27]。Yang等[28]研究茶葉內(nèi)活性物質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)TF3對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的抑制作用最強(qiáng)，TF1抑制作用相對(duì)最弱，茶黃素在保護(hù)人胚肺成纖維細(xì)胞HPF-1細(xì)胞免受H2O2介導(dǎo)的損傷方面比EGCG更為有效。

3.1.2 抑制ROS的生成

H2O2通過產(chǎn)生活性氧ROS(如超氧和羥基自由基)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。ROS氧化損傷在皮膚衰老、癌變和炎癥過程中起著重要作用，并且它可以通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。氧化應(yīng)激是關(guān)鍵的機(jī)制和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)劑生化變化涉及激活凋亡過程和發(fā)病機(jī)制的神經(jīng)退行性疾病。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)TF3可以有效抑制由H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，是茶色素中抗氧化能力最強(qiáng)的成分，Chauhan等[30]研究發(fā)現(xiàn)用甲基汞處理后的細(xì)胞，可能導(dǎo)致ROS水平的增加，而高濃度的TF3可干擾ROS信號(hào)，從而減少甲基汞對(duì)細(xì)胞的影響。

3.2 抗腫瘤性

TF3抗腫瘤的作用機(jī)理見表1。

表1 TF3抗腫瘤的作用機(jī)理Table 1 Antitumor mechanisms of TF3

由表1可知：TF3可以通過抑制生長因子受體、抗腫瘤血管形成以及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等多種方式來治療癌癥。

3.2.1 抑制生長因子受體

表皮生長因子(EGF)和表皮生長因子受體(EGFR)家族的功能激活是多數(shù)人上皮癌的特征，EGFR是癌癥治療靶點(diǎn)的生長因子受體。EGFR通過自磷酸化觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)途徑，可能導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、阻斷凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤誘導(dǎo)的新生血管形成[31]。血小板衍生生長因子受體(PDGFR)及其配體在多種人類惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用[32]。Mizuno等[33]發(fā)現(xiàn)在小鼠皮膚表皮細(xì)胞JB6CL41細(xì)胞中，用TF3預(yù)處理細(xì)胞能誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化和下調(diào)，并且這種下調(diào)是由泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的，并不需要酪氨酸激酶的激活。

Liang等[34]在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞和人表皮樣癌細(xì)胞A431細(xì)胞中，用TF3預(yù)處理細(xì)胞然后加入表皮生長因子(EGF)或血小板衍生生長因子(PDGF)，結(jié)果證明TF3與EGF或PDGF共同處理細(xì)胞均能降低EGF或PDGF誘導(dǎo)的EGFR、PDGFR自磷酸化。TF3不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用，而且其分子機(jī)制可能阻斷生長因子與其受體的結(jié)合，從而抑制有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.2.2 抗腫瘤血管形成

VEGF是調(diào)控血管生成的生長因子，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，抑制其調(diào)亡。它的表達(dá)受HIF-1影響，HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，包含HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基。高穎[35]研究證明了TF3在體內(nèi)外均具有抑制卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的能力。與EGCG相比，TF3的作用更強(qiáng)，這可能與TF3含有苯并酚酮核而EGCG沒有有關(guān)。TF3抑制人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3細(xì)胞誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚尿囊膜血管生成，通過下調(diào)HIF-1α和VEGF降低腫瘤血管生成。這些研究表明TF3可能是一種潛在的抗血管生成藥物，可用于癌癥治療。

3.2.3 促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡

抑癌蛋白p53不僅介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，而且可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)有效抗腫瘤至關(guān)重要。p53通過轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴機(jī)制誘導(dǎo)線粒體外膜通透性，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡[36]。Caspase是一類能特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞的調(diào)亡中起關(guān)鍵作用。谷胱甘肽，是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的主要貢獻(xiàn)者，它的主要功能是清除在正常的細(xì)胞呼吸過程中產(chǎn)生的自由基和過氧化物，避免脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷。

Ding等[37]研究發(fā)現(xiàn)先將TF3在37 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)孵育3 h，然后加入96孔板處理，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞的抑制作用高于TF3，由此推測TF3的降解產(chǎn)物在抗腫瘤中起關(guān)鍵作用。預(yù)先處理的TF3主要通過增加p53和Caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。Schuck等[38]研究發(fā)現(xiàn)TF3對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞HSC-2細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞GN46細(xì)胞的生長具有濃度和時(shí)間依賴性抑制作用，并且癌細(xì)胞比成纖維細(xì)胞更敏感。在TF3作用4 h后，HSC-2細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平降低，Caspase-3活性升高，由此導(dǎo)致人口腔鱗癌細(xì)胞HSC-2的凋亡。

3.3 抗菌性

Ohba等[39]研究發(fā)現(xiàn)茶黃素中的游離羥基是決定抗菌活性的重要基團(tuán)，其作用機(jī)制有以下幾個(gè)方面。

3.3.1 破壞生物膜的完整性

Wang等[40]發(fā)現(xiàn)TF3在體外對(duì)變形鏈球菌UA159具有抑制作用，通過抑制編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Gtfs)基因的表達(dá)來減少葡聚糖的形成，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞自溶和影響分泌系統(tǒng)下調(diào)了變形鏈球菌，產(chǎn)生eDNA。葡聚糖和eDNA在生物膜中可以形成支架，成為細(xì)菌的保護(hù)屏障。此外，在亞殺菌濃度條件下的TF3通過降低糖酵解相關(guān)酶和維持胞質(zhì)pH，抑制了變形鏈球菌生物膜的產(chǎn)酸，提高了耐酸性。

3.3.2 抑制基因復(fù)制

Mohammadi等[41]發(fā)現(xiàn)在高濃度的TF3和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)條件下，在一些細(xì)菌細(xì)胞中觀察到濃縮的核仁，這些物質(zhì)似乎降低了生物合成和代謝活性，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡系統(tǒng)的誘導(dǎo)。在一些高濃度TF3處理的細(xì)胞中，細(xì)胞的熒光密度低于未處理的細(xì)胞，說明TF3降低了基因組DNA的復(fù)制。

3.3.3 降低細(xì)菌的耐藥性

β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素的酶，它的分泌是β-內(nèi)酰胺類抗生素重要的耐藥機(jī)制。金屬β-內(nèi)酰胺酶是常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體產(chǎn)生的一些最著名的β-內(nèi)酰胺酶，是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性上升的關(guān)鍵因素。Teng等[42]發(fā)現(xiàn)TF3與β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusBAA1717)的協(xié)同作用。BAA1717是一種典型的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株，能高效表達(dá)多種MBLs。用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了TF3對(duì)MBLs的抑制作用，發(fā)現(xiàn)TF3與Gln242和Ser369的結(jié)合限制了MBLs的水解活性。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，Gln242和Ser369是TFDG與β-內(nèi)酰胺酶N1結(jié)合的重要?dú)埢?。此外，TF3與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌肺炎模型有明顯的保護(hù)作用。這些研究結(jié)果表明：TF3能有效地抑制MBLs的水解活性，增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)體內(nèi)外病原菌的抗菌活性。

3.4 抑制破骨細(xì)胞生成

盡管確切的機(jī)制尚不清楚，但許多研究小組報(bào)道破骨細(xì)胞在種植體周圍骨溶解(PIO)的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此，破骨細(xì)胞被認(rèn)為是治療溶骨性疾病的主要靶點(diǎn)。先前的研究已經(jīng)揭示了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路在啟動(dòng)磨損碎片刺激的骨溶解和破骨細(xì)胞形成中的關(guān)鍵作用。有越來越多的證據(jù)表明來自鈦(Ti)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯和鈷鉻等材料的磨損碎片過度激活了植入部位的破骨細(xì)胞[43-44]。轉(zhuǎn)錄譜顯示活化T細(xì)胞C1的核因子(NFATc1)是破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)骨吸收所需的許多基因的表達(dá)[45]。Hu等[46]研究表明TF3主要通過抑制ERK信號(hào)通路及其下游因子NFATc1來抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生和破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，證實(shí)了TF3對(duì)Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解有保護(hù)作用，從而防止骨丟失。這些研究結(jié)果表明TF3對(duì)磨損碎片引起的PIO有治療作用。

3.5 其他活性

胰腺脂肪酶是脂肪吸收的關(guān)鍵酶，因此，通過抑制脂肪酶來減少脂肪的吸收是抑制體重增加的有效方法。Kobayashi等[47]研究發(fā)現(xiàn)具有沒食子酸部分的TF2A，TF2B和TFDG以劑量依賴的方式抑制胰腺脂肪酶的活性，并且在相同濃度下TF3比EGCG和ECG混合物可以更加有效地抑制胰腺脂肪酶的活性。

縫隙連接蛋白43(Cx43)是心肌細(xì)胞中最廣泛表達(dá)的連接蛋白，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可以逆轉(zhuǎn)高糖條件下新生大鼠心肌細(xì)胞NRCMs中Cx43的下調(diào)。Shen等[48]發(fā)現(xiàn)TF3是通過恢復(fù)部分AMPK活性實(shí)現(xiàn)了部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的NRCMs細(xì)胞中Cx43表達(dá)和自噬的抑制。抑制自噬可能是通過保留高糖刺激的NRCMs細(xì)胞中Cx43的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)理是TF3在蛋白質(zhì)水平上可以減輕對(duì)Cx43表達(dá)的抑制，改善縫隙連接功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TF3可能是通過激活A(yù)MPK改善糖尿病和心肌病人的心肌細(xì)胞行為的候選藥物。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性炎癥性疾病，在世界范圍內(nèi)有大量的患者。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的特征是滑膜增生、滑膜關(guān)節(jié)持續(xù)慢性炎癥和各種活化免疫細(xì)胞浸潤[49]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)參與與骨和軟骨相關(guān)的基質(zhì)的變性。TF3是一種對(duì)炎癥因子有抑制作用的多酚。Liu等[50]研究發(fā)現(xiàn)了TF3對(duì)RA的衰減作用，TF3可以明顯降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分和發(fā)病率，并能顯著延遲關(guān)節(jié)炎的發(fā)生1周。組織學(xué)分析表明：TF3能減輕CIA小鼠滑膜炎癥和軟骨骨破壞，使滑膜增生、軟骨破壞和骨侵蝕程度由載藥組的重度減至輕度。其作用機(jī)理主要是通過抑制炎癥細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)。

4 結(jié) 論

目前關(guān)于茶黃素和茶黃素雙沒食子酸酯的吸收和代謝的信息非常有限，因此應(yīng)該對(duì)這些化合物的安全性、吸收和代謝進(jìn)行更多的研究。茶黃素的口服生物利用度非常低，目前可以通過納米包埋技術(shù)提高植物多酚的生物利用度，蛋白質(zhì)納米顆粒和殼聚糖是植物多酚中最常用的納米載體，有大量證據(jù)表明它們可以改善酚類化合物在腸道的吸收，并且增強(qiáng)其生理活性。茶黃素雙沒食子酸酯作為多酚類物質(zhì)的一種，目前已有少量研究證實(shí)了可以通過類似技術(shù)方法來提高生物利用度，還需要更多的研究來支持這一觀點(diǎn)。此外，茶黃素雙沒食子酸酯在茶葉中含量低，提取成本高，僅僅通過在茶葉中提取來應(yīng)用于藥品和保健品是不現(xiàn)實(shí)的，采用現(xiàn)代科技手段如酶促氧化合成茶黃素雙沒食子酸酯，可以大大提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要意義。