免疫抑制劑他克莫司研究進(jìn)展

金美英，方晨捷，陳 燏，張 博，劉 平，柳志強(qiáng)

(1.杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310011；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

當(dāng)前，全世界范圍內(nèi)由于肝病、腎病等原因需要移植器官的患者數(shù)量逐年增加。中國(guó)每年需要器官移植的患者人數(shù)約有30萬(wàn)人。中國(guó)于2018年共完成器官移植手術(shù)20 201例，位居世界第二位，亞洲第一位。器官移植作為這些患者的重要治療手段，越來(lái)越受到廣泛重視[1]。早在20世紀(jì)70年代末，科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)一些真菌代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，且選擇性較好。在發(fā)現(xiàn)他克莫司之前，臨床上常用環(huán)孢素A(CsA)作為免疫抑制劑來(lái)治療器官移植后的排斥反應(yīng)。CsA也是一種CaN抑制劑，免疫抑制機(jī)制與他克莫司類似，但他克莫司的作用效果是CsA的100倍左右[2]。1993年，他克莫司膠囊在日本首次批準(zhǔn)上市，商品名是“普樂(lè)可復(fù)”。隨后其經(jīng)FDA獲準(zhǔn)后，相繼在多個(gè)國(guó)家上市使用。他克莫司自上市以來(lái)廣泛用于肝、腎和骨髓移植的急慢性排斥治療，已成為臨床上肝、腎移植后治療排斥反應(yīng)的一線藥物。國(guó)內(nèi)的他克莫司市場(chǎng)基本上被Astellas公司的原研藥“普樂(lè)可復(fù)”所占據(jù)，且原研藥“普樂(lè)可復(fù)”較國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品價(jià)格高出30%～50%左右。1 mg規(guī)格的他克莫司膠囊，原研藥品銷售價(jià)格在1 200元左右。

隨著他克莫司合成基因簇的闡釋和代謝途徑的解析，通過(guò)基因工程和代謝工程手段提高其產(chǎn)量的研究逐年增加。筆者綜述他克莫司藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的研究近況，介紹其合成基因簇和代謝途徑，并總結(jié)了近年來(lái)通過(guò)代謝工程手段提升菌株他克莫司產(chǎn)量的相關(guān)研究。

1 他克莫司的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究

1.1 他克莫司的藥代動(dòng)力學(xué)研究

他克莫司主要經(jīng)小腸吸收，且吸收個(gè)體差異性大，進(jìn)食會(huì)影響其血藥濃度，但其吸收不受膽汁影響。其體內(nèi)半衰期為3.5～40.5 h，平均為8.7 h。他克莫司的體內(nèi)血藥濃度由許多因素所決定，如性別、年齡、種族、遺傳差異和病理生理狀態(tài)等。而遺傳差異是導(dǎo)致個(gè)體之間血藥濃度差距的主要影響因素。他克莫司在體內(nèi)主要由肝臟代謝，其血藥濃度與人體中相關(guān)代謝酶的活性高度相關(guān)。CYP3A酶是CYP450酶中重要的亞家族，作為藥物代謝和口服藥物首關(guān)效應(yīng)的主要酶系存在。CYP3A酶包括4種同工酶：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。參與他克莫司代謝的主要是CYP3A4和CYP3A5，其酶活的增高會(huì)增加他克莫司非活性代謝物，從而降低血藥濃度，反之亦然[3]。它們中CYP3A5的基因多態(tài)性與遺傳差異高度相關(guān)，根據(jù)CYP3A5*3的表型不同，可將人群分為快代謝型(*1/*1，野生型)、中代謝型(*1/*3，雜合型)及慢代謝型(*3/*3，純合突變型)[4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)漢族人群中CYP3A5*3的突變率高達(dá)72.17%。他克莫司的藥代動(dòng)力學(xué)個(gè)體之間差異顯著，相同劑量給藥情況下個(gè)體之間的血藥濃度也可能相差數(shù)倍。各國(guó)指南中基于CYP3A5基因型推薦使用的他克莫司起始劑量見(jiàn)表1[3]，為臨床上對(duì)他克莫司合理、安全地用藥提供了參考。

表1 基于CYP3A5基因型他克莫司用藥起始劑量Table 1 Starting dose of tacrolimus based on CYP3A5 genotype

1.2 他克莫司的藥效學(xué)研究

他克莫司治療腎臟器官移植排斥反應(yīng)療效顯著[6]。Cheung等[7]對(duì)76位腎移植患者長(zhǎng)達(dá)8年的前瞻性研究表明：他克莫司治療組活檢證實(shí)的急性排斥反應(yīng)發(fā)生率顯著低于環(huán)孢素治療組(分別為18.4%和42.1%，P=0.03)；且他克莫司治療組患者發(fā)生高膽固醇血癥概率也顯著更低(P=0.05)。Mizuiri等[8]對(duì)使用環(huán)孢素A和他克莫司治療的63名腎移植患者進(jìn)行腎活檢顯示，他克莫司(10～14 ng/mL，n=20)治療組腎小管間質(zhì)中CD68陽(yáng)性細(xì)胞比環(huán)孢素治療組(180～220 ng/mL，n=43)較少(分別為0.9±0.8和1.5±0.9，P<0.01)，而腎小管間質(zhì)中CD68陽(yáng)性細(xì)胞較多的患者移植存活率較低(P<0.05)，且腎間質(zhì)中NF-kB(Nuclear factor-kappa B)與腎小管間質(zhì)的CD68顯著相關(guān)(P<0.01)，環(huán)孢素治療組患者中巨噬細(xì)胞數(shù)量較他克莫司治療患者更多，腎小管間質(zhì)巨噬細(xì)胞侵襲和NF-kB活化存在顯著相關(guān)性，NF-kB活化又與排斥反應(yīng)的發(fā)生明顯相關(guān)。因此，在抵抗巨噬細(xì)胞入侵和預(yù)防及治療排斥反應(yīng)方面，他克莫司比環(huán)孢素療效更好。此外，Hymes等[9]先使用環(huán)孢素A治療腎移植兒童，連續(xù)3 d服用高劑量糖皮質(zhì)激素(10 mg/kg)后，腎活檢顯示發(fā)生急性排斥反應(yīng)，而將環(huán)孢素?fù)Q為他克莫司后，移植早期(12周內(nèi))及晚期(12周后)急性排斥反應(yīng)均得到控制，此研究表明對(duì)腎移植兒童服用高劑量糖皮質(zhì)激素發(fā)生的急性排斥反應(yīng)，他克莫司的免疫抑制效果較環(huán)孢素更優(yōu)。白楊娟等[10]研究結(jié)果表明：在治療肝移植患者中，環(huán)孢菌素A治療組中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面CD28、CD152分子表達(dá)均明顯高于他克莫司治療組(P<0.05)，他克莫司可同時(shí)抑制T細(xì)胞正性共刺激分子白細(xì)胞表面分化抗原(CD28)和可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)表達(dá)并促進(jìn)T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)分子相關(guān)抗原(CD152)表達(dá)，而環(huán)孢菌素A對(duì)T細(xì)胞免疫抑制作用主要是通過(guò)促進(jìn)CD152分子的高表達(dá)介導(dǎo)，這從另一個(gè)方面解釋了他克莫司藥效比環(huán)孢素強(qiáng)的原因。

動(dòng)物模型研究也證實(shí)他克莫司不僅可用作初級(jí)預(yù)防性治療藥物也可在臨床器官移植的抗排斥治療起到很好的免疫作用。小鼠心臟移植實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)他克莫司為一種治療慢性排斥反應(yīng)有效的免疫抑制劑[4]。Jiang等[11]在心臟移植小鼠發(fā)生持續(xù)性排斥反應(yīng)模型中，觀察到每天3.2 mg/kg他克莫司治療的受體大鼠相比于每天用10 mg/kg環(huán)孢菌素A治療的受體大鼠，IL-10在他克莫司治療的患者移植器官中被顯著抑制，心臟組織中CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)也降低，小鼠平均存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。研究結(jié)果表明：他克莫司能有效減輕持續(xù)性排斥反應(yīng)，并且IL-10可能是他克莫司特異性細(xì)胞毒性介質(zhì)，在調(diào)節(jié)的同種異體移植排斥反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。

他克莫司治療窗較窄，低濃度易發(fā)生移植排斥反應(yīng)，高濃度會(huì)引起毒性反應(yīng)，而嚴(yán)重不良反應(yīng)將直接影響其臨床應(yīng)用。Khoury等[12]觀察85名腎移植患者服用他克莫司后發(fā)現(xiàn)，23%患者獲得糖尿病，13%患者出現(xiàn)過(guò)單次可逆性高血糖發(fā)作，其中只有4.7%患者明確需要使用胰島素治療，表明使用他克莫司引起糖尿病是較輕微的，可以通過(guò)飲食和口服降糖藥容易地控制。

此外，他克莫司還引起高血壓、高鉀血癥、增加腫瘤及感染的風(fēng)險(xiǎn)；他克莫司使用后中性粒細(xì)胞減少、急性造血功能停滯，常規(guī)劑量導(dǎo)致免疫抑制過(guò)度、牙齦增生、溶血性尿毒性綜合征等，也會(huì)引起肝臟毒性，并引發(fā)癲癇、遲發(fā)性后部腦白質(zhì)病變、視神經(jīng)損害、失語(yǔ)癥等不良反應(yīng)，導(dǎo)致這些不良反應(yīng)的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。因此，臨床上在使用他克莫司時(shí)需密切監(jiān)測(cè)患者的血藥濃度、血肌酐、尿量及肝功能等指標(biāo)，重視他克莫司的給藥時(shí)機(jī)、劑量調(diào)整等，從而減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

2 他克莫司的理化性質(zhì)與免疫抑制機(jī)制

他克莫司是由鏈霉菌屬(Streptomyces)發(fā)酵得到的產(chǎn)物。到目前為止，已報(bào)道超過(guò)15種產(chǎn)生他克莫司的菌種[13]，包括Streptomycestsukubaensis9993，Streptomycestacrolimicus，Streptomycessp. ATCC 53770，Streptomycessp. MA6949，StreptomycesglaucescensMTCC 5115，StreptomycesclavuligerusCKD1119等。他克莫司是一種高效的23元大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，常溫下為無(wú)色晶體，熔點(diǎn)為127～129 ℃，溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，難溶于己烷或石油醚，不溶于水，在不同貯存條件下穩(wěn)定性都較高[14]，分子式是C44H69NO12，相對(duì)分子質(zhì)量為804.02[15]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

他克莫司對(duì)于T淋巴細(xì)胞的增殖抑制顯著，其中主要是作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑發(fā)揮作用，并顯示出與環(huán)孢菌素A非常相似的作用機(jī)制。具體機(jī)制是當(dāng)他克莫司與其細(xì)胞溶質(zhì)受體(主要是FKBP12-)相互作用時(shí)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性受到抑制。在這種情況下，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶不再能使轉(zhuǎn)錄因子(例如NFAT)去磷酸化，而去磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子是控制T細(xì)胞增殖所必需的。這種機(jī)制在人類T淋巴細(xì)胞和酵母等真菌細(xì)胞中是保守的，因此他克莫司也具有抗真菌活性。該活性可用于通過(guò)對(duì)易感菌株如釀酒酵母TB23的生物測(cè)定來(lái)定性檢測(cè)他克莫司[16]。

3 他克莫司的生物合成研究

1984年，日本藤澤公司研究所從日本筑波山土壤中分離出的筑波鏈霉菌發(fā)酵液中提取得到了他克莫司。但最初的他克莫司的發(fā)酵產(chǎn)量極低。不過(guò)通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，產(chǎn)量可提高10倍以上。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了菌株的改良和發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，生產(chǎn)能力提高了幾十倍[14]。

國(guó)內(nèi)一些研究是圍繞發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化和原始菌株誘變篩選展開(kāi)的。邱觀榮等[17]通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇玉米淀粉及葡萄糖作為主碳源，選用黃豆粉和玉米漿為主氮源，且確定最佳碳氮源組合(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為2.0%葡萄糖，6.0%玉米淀粉，2.0%黃豆粉，0.5%玉米漿。最終得到適合的種子菌齡為48 h，培養(yǎng)基的初始pH為7.5，500 mL三角瓶較佳裝液量為50 mL，搖瓶適宜轉(zhuǎn)速為250 r/min，適宜發(fā)酵溫度為27 ℃，最佳接種量為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，最佳發(fā)酵周期為7 d。優(yōu)化組發(fā)酵液中的平均發(fā)酵水平最終達(dá)586 μg/mL，與對(duì)照組相比提高60%以上。顧駿等[18]先通過(guò)兩水平因子設(shè)計(jì)方法找到培養(yǎng)基中重要的影響因子，然后確定其合適的濃度范圍，再通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析方法，最終確定培養(yǎng)基各成分最佳的濃度配比。經(jīng)優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基為葡萄糖6.14 g/L，酵母粉1.52 g/L，黃豆餅粉5 g/L，花生餅粉12.28 g/L，玉米淀粉30 g/L，K2HPO45 g/L。相對(duì)于初始發(fā)酵培養(yǎng)基，他克莫司產(chǎn)量由60 μg/mL提升至90 μg/mL，提高了約55%。傅立峰等[19]通過(guò)研究不同發(fā)酵條件對(duì)他克莫司發(fā)酵的影響，獲得了最適搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：種子培養(yǎng)基中以1.5 g/L葡萄糖為輔碳源，種子培養(yǎng)時(shí)間40 h，500 mL搖瓶適宜裝液量為20 mL，適宜接種量為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；20噸發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中溶氧控制在20%以上，適宜發(fā)酵周期為7 d，在發(fā)酵第4天和第5天進(jìn)行分批補(bǔ)料，最終發(fā)酵得到他克莫司的質(zhì)量濃度為1 150 μg/mL。王會(huì)會(huì)等[20]采用具有低成本、操作方便等優(yōu)點(diǎn)的常壓室溫等離子體(ARTP)技術(shù)[21]對(duì)他克莫司產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理。利用ARTP誘變20 s，獲得初始突變菌，從初篩的127株菌株中得到4株高產(chǎn)的誘變菌株，其中FK18-1-56較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了162%，且連續(xù)傳4代菌株產(chǎn)量穩(wěn)定。王秀琴等[22]通過(guò)復(fù)合誘變方法篩選得到新菌株08-9-81較出發(fā)菌株的發(fā)酵水平提高73.6%。

Kosec等[23]開(kāi)發(fā)了一種新的化學(xué)生物合成方法能夠顯著減少副產(chǎn)物子囊霉素(FK520)和雙氫他克莫司(FK506D)的產(chǎn)生。在StreptomycestsukubaensisallR基因缺失突變株的發(fā)酵過(guò)程中外源添加烯丙基丙二酰-SNAC可觀測(cè)到僅有FK506的生成，沒(méi)有可檢測(cè)量FK520及FK506D的產(chǎn)生。但其他克莫司(FK506)的產(chǎn)量顯著低于野生型，經(jīng)對(duì)照組對(duì)比分析結(jié)果可得烯丙基丙二酰-SNAC對(duì)野生型菌株具有一定毒性。此后還可通過(guò)菌株篩選和進(jìn)料優(yōu)化進(jìn)一步提高FK506產(chǎn)量。

Xia等[24]通過(guò)代謝組學(xué)，利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS)兩種分析方法分別分析了中心碳代謝途徑(EMP、TCA和PPP)、莽草酸途徑、氨基酸代謝途徑和脂肪酸代謝途徑中的23種主要代謝物；通過(guò)比較代謝分析確定了13種關(guān)

鍵代謝物與FK506的合成密切相關(guān)；通過(guò)分析不同時(shí)間不同濃度的補(bǔ)料與產(chǎn)量之間的關(guān)系最終確定了一個(gè)合理的補(bǔ)料策略。首先他們發(fā)現(xiàn)適量乳酸的添加能增加FK506的產(chǎn)量，在36 h添加終質(zhì)量濃度為15 g/L的乳酸能使FK506產(chǎn)量從251 mg/L增加到281 mg/L；同時(shí)觀察到外源添加丙酮酸會(huì)使菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成均受到抑制；其原因可能是菌株不能有效利用外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及有機(jī)酸的積累導(dǎo)致發(fā)酵液pH的降低。在96 h添加終質(zhì)量濃度為1.5 g/L的琥珀酸鈉能使FK506的產(chǎn)量提高28%達(dá)到321 mg/L。在72 h添加1.5 g/L莽草酸、0.1 g/L苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸能使產(chǎn)量最大提高達(dá)到41.8%。纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸和蘇氨酸的添加會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)各種CoA酯增加，從而顯著刺激FK506的產(chǎn)生。在24 h加入10 g/L豆油會(huì)使FK506產(chǎn)量提高44%，表明脂肪酸和CoA酯前體的形成密切相關(guān)。Wang等[25]也觀測(cè)到三酰甘油能削弱鏈霉菌中乙酰CoA到TCA的碳通量同時(shí)增強(qiáng)聚酮化合物的生成，他們將相關(guān)基因SCO6196置于二甲氨基二硫代甲酸銅(Cumate)誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下，構(gòu)建了相關(guān)ddTAG策略，通過(guò)選擇性控制TAG降解的時(shí)間和強(qiáng)度有效提高相關(guān)聚酮化合物產(chǎn)量。他們?cè)诜啪€菌素、杰多霉素B、土霉素以及阿維菌素B1a生產(chǎn)菌株中都成功應(yīng)用了該策略使得相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量得到了提升。

4 他克莫司的合成基因簇及組裝機(jī)制研究

目前，他克莫司生物合成基因簇已被測(cè)序，且確定了獲得的大多數(shù)基因在他克莫司合成中所起到的作用，見(jiàn)圖1。其中tcsA、tcsB、tcsC和tcsD負(fù)責(zé)烯丙基丙二酰基-ACP的生物合成；fkbG、fkbH、fkbI、fkbJ和fkbK負(fù)責(zé)甲氧基丙二?；?ACP的合成；fkbA、fkbB和fkbC負(fù)責(zé)延伸單元的連接與縮化；fkbL負(fù)責(zé)哌啶酸的生物合成；fkbD負(fù)責(zé)他克莫司C9的羥基化、氧化，產(chǎn)生β-羰基酰胺；fkbM負(fù)責(zé)C31的羥基甲基化；fkbP負(fù)責(zé)哌啶酸與內(nèi)酯環(huán)連接[26]。

圖1 他克莫司合成基因簇Fig.1 Biosynthetic gene clusters of tacrolimus

20世紀(jì)90年代默克公司首先研究了他克莫司生物合成途徑。他克莫司是由fkb基因簇編碼的雜合聚酮化合物Ⅰ合酶-非核糖體肽合酶(PKSI-NRPS)系統(tǒng)合成的聚酮化合物。他克莫司結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，內(nèi)酯環(huán)由5個(gè)甲基丙二酰、2個(gè)丙二酰、2個(gè)甲氧基丙二酰和1個(gè)烯丙基丙二酰延伸單元組成。他克莫司生物合成的第一步是通過(guò)FkbO將分支酸轉(zhuǎn)化成(4R，5R)-4，5-二羥基環(huán)己-1-烯羧酸(簡(jiǎn)稱DHCHC)。DHCHC作為隨后形成碳骨架的起始單元，與他克莫司最終結(jié)構(gòu)中的環(huán)己烷環(huán)相對(duì)應(yīng)。聚酮合成酶FkbA，F(xiàn)kbB和FkbC以丙二酰輔酶A(2分子)，甲基丙二酰輔酶A(5分子)，甲氧基丙二?；?ACP(2分子)和烯丙基丙二酰輔酶A(1分子)為擴(kuò)展單元催化來(lái)自DHCHC的10個(gè)延伸步驟[16]。對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯的環(huán)化，F(xiàn)kbL從L-賴氨酸生成L-哌啶酸，然后由NRPS-FkbP將其并入碳骨架。最后C31處羥基的甲基化和C9處的氧化對(duì)他克莫司與FKBP-12的結(jié)合都很重要，是免疫抑制活性所必需的基團(tuán)。甲基化是由S-腺苷甲基化依賴的O-甲基轉(zhuǎn)移酶FkbM催化的，氧化是由細(xì)胞色素P450氧化還原酶FkbD催化的。而當(dāng)C21位R官能團(tuán)為甲基，即他克莫司合成過(guò)程中此位點(diǎn)上的烯丙基丙二酰輔酶A被乙基丙二酰輔酶A替換時(shí)生成產(chǎn)物為子囊霉素(FK520)。當(dāng)C21位R官能團(tuán)雙鍵被加氫，則產(chǎn)物為雙氫他克莫司(FK506D)[14]。

5 他克莫司代謝途徑研究及代謝工程改造

代謝工程技術(shù)是通過(guò)基因工程手段理性改造宿主細(xì)胞基因組，獲得高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的菌株[27]。對(duì)合成他克莫司的原料來(lái)源進(jìn)行分析：DHCHC來(lái)源于分支酸；擴(kuò)展單元丙二酰輔酶A和烯丙基丙二酰輔酶A來(lái)源于乙酰輔酶A；甲基丙二酰輔酶A來(lái)源于纈氨酸形成的丙酰輔酶A和TCA中的琥珀酰輔酶A；甲氧基丙二?；?ACP來(lái)源于糖酵解途徑的1，3-二磷酸甘油酸；L-哌啶酸來(lái)源于L-賴氨酸。詳細(xì)的代謝途徑[24]如下。

糖酵解相關(guān)代謝途徑為

三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝途徑為

他克莫司組裝相關(guān)代謝途徑為

Chen等[28]對(duì)烯丙基丙二酰輔酶A和甲氧基丙二酰基-ACP相關(guān)合成基因分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)，他克莫司產(chǎn)量從原始菌株的46.9 mg/L分別提高到95.7,61.3 mg/L。Huang等[29]在S.tsukubaensisD852菌株中分別及不同組合過(guò)表達(dá)fkbO、fkbP、fkbL、fkbM和fkbD，發(fā)現(xiàn)這些基因的過(guò)表達(dá)對(duì)于他克莫司的產(chǎn)量都有不同程度的提升，最終構(gòu)建了同時(shí)過(guò)表達(dá)5個(gè)基因的菌株HT-FKBOPLMD，其產(chǎn)量達(dá)到(353.2±8.5) mg/L，較起始菌株產(chǎn)量提高了約150%；Huang等[30]通過(guò)基因組規(guī)模代謝模型分析構(gòu)建了一株gdhA缺失和dahp，accA2，zwf2過(guò)表達(dá)的菌株HT-ΔGDH-DAZ使FK506質(zhì)量濃度增加至398.9 mg/L，而原始菌株D852產(chǎn)量為158.7 mg/L；Wang等[31]對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)權(quán)重分析(WGCNA)以及使用基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型(GSMM)確定了兩個(gè)新的改造位點(diǎn)aroC和dapA。接著對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)分支酸和賴氨酸生物合成的菌株HT-aroC/dapA能夠產(chǎn)生128.19 mg/L他克莫司，比對(duì)照(78.26 mg/L)高了1.64倍。Wang等[32]通過(guò)構(gòu)建一種GS-DFBA模型揭示了遺傳操作的新靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)gcdh和tktB的失活與msdh和ask的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致他克莫司產(chǎn)量增加，其中g(shù)cdh、tktB、msdh和ask分別編碼戊二酰-CoA脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、甲基丙二酸半醛脫氫酶和天冬氨酸激酶。由此可見(jiàn)，上述酶在他克莫司的合成過(guò)程中起到一定作用。

6 結(jié) 論

他克莫司作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植的免疫排斥反應(yīng)的治療。研究表明不同基因型的個(gè)體在相同劑量給藥下血藥濃度差距甚大，故不同國(guó)家出臺(tái)了相關(guān)指南為合理、安全用藥提供了參考。在藥效學(xué)的研究中證實(shí)他克莫司在治療效果、副反應(yīng)方面都較同類藥物環(huán)孢霉素A更優(yōu)。研究發(fā)現(xiàn)他克莫司可在多種菌種中產(chǎn)生，但根據(jù)產(chǎn)量及菌種研究的深度一般選擇Streptomycestsukubaensis進(jìn)行進(jìn)一步研究。StreptomycestsukubaensisFK506合成基因簇的闡明及其合成代謝途徑的解析為后續(xù)針對(duì)FK506的研究提供了理論基礎(chǔ)以及改造框架。通過(guò)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化可以有效地提高FK506的產(chǎn)量，同時(shí)原始菌株的誘變篩選也對(duì)FK506產(chǎn)量有一定的提升。結(jié)合相關(guān)調(diào)控基因的深入解析，通過(guò)對(duì)相關(guān)基因的敲除同時(shí)外源添加相關(guān)物質(zhì)可切實(shí)減少副產(chǎn)物的生成。利用代謝組相關(guān)分析技術(shù)確定一些在FK506合成過(guò)程中的關(guān)鍵代謝物，同時(shí)與發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)添加可有效提高FK506的產(chǎn)量。然而，傳統(tǒng)鏈霉菌基因工程和代謝工程的操作手段較為復(fù)雜，這阻礙了相關(guān)產(chǎn)物的研究發(fā)展進(jìn)程。新的基因編輯技術(shù)的興起以及鏈霉菌多種強(qiáng)啟動(dòng)子的解析為FK506產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了巨大的前景。從目前的研究成果可以看出，大多數(shù)基因工程菌的FK506產(chǎn)量大幅提高都是通過(guò)外源添加相關(guān)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。因此，亟待研究的就是通過(guò)基因工程和代謝工程手段對(duì)Streptomycestsukubaensis中FK506整個(gè)合成代謝途徑進(jìn)行改造，在減少副產(chǎn)物生成的同時(shí)提高FK506在生產(chǎn)菌株中的產(chǎn)量，從而降低產(chǎn)品成本，提高工業(yè)化的水平。