過表達(dá)熱激蛋白提高釀酒酵母的耐高溫高乙醇性能

陳勝杰，高 翔，袁戎宇

(廣東怡和科潔科技有限公司，廣東 佛山 528000)

酵母作為最常見的單核真菌，在人類歷史上起到了舉足輕重的作用。在很早以前，人們就懂得利用酵母釀果酒、發(fā)酵面包等[1]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，啤酒飲料的消費(fèi)熱度居高不下，其中的發(fā)酵菌主力就是釀酒酵母[2]。為了滿足大眾的需求和口味，科研工作者們一直致力于研發(fā)更高效穩(wěn)定的工程菌，例如能耐高溫、耐高乙醇的釀酒酵母就是科學(xué)家一直努力的方向[3]。筆者致力于通過分子生物學(xué)基因改造手段，對出發(fā)菌株有目的地加強(qiáng)熱休克蛋白的表達(dá)，通過整合質(zhì)粒過表達(dá)的形式，對sym1和hsp104兩個(gè)基因過表達(dá)，觀察改造菌的高溫高乙醇的生物學(xué)性狀，并通過代謝流量分析等手段，評判其改造效果，為以后的研究提供參考。

sym1來自釀酒酵母S288C(S.cerevisiaeS288C)，是編碼釀酒酵母熱休克蛋白的關(guān)鍵基因，在熱休克期間，sym1基因具有耐高溫和耐乙醇的抗性，其功能和壓力誘導(dǎo)的酵母MPV17功能相似[4]。hsp104基因來自馬克思克魯維酵母DMKU3-1042，也是編碼熱休克蛋白的關(guān)鍵基因，能夠在高溫(37～45 ℃)高乙醇脅迫下發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞裂解死亡，提高細(xì)胞存活率[5]。Sales等[6]利用缺失突變體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了Hsp104p可以直接影響釀酒酵母的乙醇耐性；Sanchez等[5]測試了hsp104突變體的乙醇耐受性與親本菌株的差別，研究結(jié)果證明熱誘導(dǎo)后，親本菌株可耐受20%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而突變株則不能承受該乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑盒：均購自北京博邁德科技發(fā)展公司；質(zhì)粒：酵母過表達(dá)質(zhì)粒-YCplac33，遺傳標(biāo)記為Ampr，URA3，購自金唯智生物科技有限公司；出發(fā)菌株：釀酒酵母S.cerevisiaeYH，來自筆者公司菌種保藏庫。引物見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)列表Table 1 Primer design list

注：帶下劃線的斜體部分堿基序列為對應(yīng)的酶切位點(diǎn)序列。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電擊轉(zhuǎn)化儀，德國eppendorf公司；MiniSpin高速離心機(jī)，德國eppendorf公司；電泳儀(DYY-6C)，北京六一儀器廠；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能凝膠成像系統(tǒng)公司；PCR儀，德國eppendorf公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株S.cerevisiaeYH+的構(gòu)建

1) 構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-sym1

根據(jù)酵母染色體上基因Sym1上下游序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。以S.cerevisiaeS288C染色體DNA為模板，分別以Sym1F和Sym1R兩對引物作為下游引物。按照體系添加到擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物長度為979 bp(為保證片段的完整性，實(shí)際片段長594 bp，對其上下游均延長200 bp設(shè)計(jì)引物)，PCR擴(kuò)增體系見表2。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；重復(fù)第2～4步驟，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保藏。

表2 PCR擴(kuò)增體系Table 2 PCR amplification system

用EcoRⅠ和KasⅠ分別對克隆基因Sym1的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33載體進(jìn)行雙酶切消化，然后分別將目的基因片段進(jìn)行回收純化，將外源PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體按適當(dāng)比例進(jìn)行連接，然后挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證得到正確的克隆[7]。雙酶切連接sym1體系見表3。

表3 雙酶切連接sym1體系Table 3 Double enzyme cleavage linkage system of gene sym1

2) 過表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-sym1-hsp104

根據(jù)馬克思克魯維酵母DMKU3-1042(KluyveromycesmarxianusDMKU3-1042，記作K.marmianusD3)染色體上基因hsp104的上下游序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。以K.marmianusD3染色體DNA為模板，分別以Hsp104F和Hsp104R作為基因的擴(kuò)增引物，按照PCR體系添加到擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得的PCR產(chǎn)物長度為2 933 bp(為保證片段的完整性，實(shí)際片段長2 727 bp，對其上下游均延長200 bp設(shè)計(jì)引物)。然后雙酶切連接hsp104基因，對應(yīng)的雙酶切位點(diǎn)是Hind Ⅲ、BamHⅠ。采用與sym1類似的辦法，將hsp104基因連接到質(zhì)粒YCplac33載體上，具體的酶切體系見表4。構(gòu)建得到過表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-sym1-hsp104(記作：Y Cplac33-SH)。

表4 雙酶切連接hsp104體系Table 4 Double Enzyme cleavage linkage system of gene hsp104

3) 構(gòu)建含表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-SH的菌株S.cerevisiaeYH+。

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒YCplac33-SH，電轉(zhuǎn)化入S.cerevisiaeYH的感受態(tài)細(xì)胞中，然后挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子。斜面富集培養(yǎng)后，用無菌水沖刷，并與體積分?jǐn)?shù)為30%的無菌甘油溶液1∶1混合于保菌管中，-20 ℃保藏備用[8]，改造菌株記作S.cerevisiaeYH+。

1.2.2 高溫高乙醇脅迫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將改造菌置于不同溫度和不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度脅迫下進(jìn)行測試[9]。其中，溫度梯度實(shí)驗(yàn)在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下進(jìn)行，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度實(shí)驗(yàn)在32 ℃下進(jìn)行。最后選取適當(dāng)?shù)臏囟葪l件(接近50%存活率)，進(jìn)行乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度存活率實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 利用代謝網(wǎng)路分析驗(yàn)證改造菌的代謝通路變化

代謝通量分析主要采用化學(xué)計(jì)量網(wǎng)絡(luò)分析提供可平衡及可計(jì)算的代謝反應(yīng)，確定細(xì)胞內(nèi)各代謝物的通量分布。筆者以Nissen等[10]代謝模型為標(biāo)準(zhǔn)，參考曹利民[4]擬穩(wěn)態(tài)方程組，S×r=0。其中S為化學(xué)計(jì)量系數(shù)矩陣，r是37個(gè)變量的向量，在擬穩(wěn)態(tài)下該模型有27個(gè)化合物處于平衡態(tài)，所以該模型的自由度為10。通過測定工程菌株和出發(fā)菌株分批發(fā)酵過程中相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算在對數(shù)生長期14～15 h各菌株達(dá)到的最大比生長速率，計(jì)算并比較改造菌和出發(fā)菌株在發(fā)酵前后的通量分布差異，用來考察基因修飾策略是否正確。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株S.cerevisiae YH+構(gòu)建過程中的相關(guān)電泳圖及生長曲線

S.cerevisiaeYH+菌株陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切驗(yàn)證PCR電泳圖如圖1所示。其中，圖(a)為過表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-sym1的EcoR Ⅰ、KasⅠ雙酶切電泳圖(1 140 bp和5 442 bp，質(zhì)粒大小6 582 bp)；圖(b)為過表達(dá)+質(zhì)粒Y Cplac33-SH的Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切電泳圖(2 963 bp和6 552 bp，質(zhì)粒大小9 515 bp)。

M—marker；1—雙酶切后線性質(zhì)粒和sym1基因；2—雙酶切后線性質(zhì)粒和hsp104基因。圖1 S.cerevisiae YH+菌株陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切驗(yàn)證PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis strip of S.cerevisiae YH+positive transmutator double enzyme digestion

從雙酶切PCR電泳條帶可以看出：質(zhì)粒Y Cplac33-SH已成功轉(zhuǎn)入菌株S.cerevisiaeYH體內(nèi)，得到改造菌S.cerevisiaeYH+。

測定改造菌株S.cerevisiaeYH+的生長曲線：于37 ℃，200 r/min，250 mL搖瓶裝液量30 mL培養(yǎng)，每4 h取樣一次，共培養(yǎng)36 h，測其OD600值，并繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 改造菌與出發(fā)菌的生長曲線對比Fig.2 Comparison of growth curve of modified bacteria and original bacteria

由圖2可知：改造菌的生長趨勢與出發(fā)菌大致相同，菌株生長的對數(shù)期在8～20 h，OD600最高值為31.7，較出發(fā)菌(33.6)有輕微下降，分析原因，可能是質(zhì)粒導(dǎo)入后，增加了菌株的生長壓力[11]。

2.2 菌株S.cerevisiae YH+的高溫高乙醇脅迫實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)改造菌的耐高溫高乙醇能力，在不同發(fā)酵溫度梯度和發(fā)酵液中不同的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度條件下，對改造菌進(jìn)行沖擊測試，考察菌細(xì)胞存活率。其中，溫度梯度實(shí)驗(yàn)在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下進(jìn)行，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度實(shí)驗(yàn)在32 ℃下進(jìn)行。最后在接近50%存活率的溫度下，進(jìn)行乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度存活率實(shí)驗(yàn)。具體的壓力脅迫梯度見表6，具體結(jié)果如圖3，4所示。

表6 脅迫條件梯度表Table 6 Pressure stress ladder

圖3 10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，不同溫度對菌株存活率的影響Fig.3 Influences of different temperature on the survival rate of strains under 10% ethanol

圖4 32 ℃下不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株存活率的影響Fig.4 Influences of different ethanol concentrations on the survival rate of strains under 32 ℃

由圖3可知：在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)10 h，改造菌在常溫28，32 ℃時(shí)，菌株存活率比出發(fā)菌略高，分別為92.7%和89.1%，比出發(fā)菌分別高出7.2%和5.9%，但相差不明顯。而在溫度進(jìn)一步升高后，即40 ℃和45 ℃時(shí)，改造菌的抗高溫能力得到了較好的體現(xiàn)，其細(xì)胞存活率相比出發(fā)菌優(yōu)勢愈發(fā)明顯，具體表現(xiàn)為在40 ℃時(shí)，改造菌的細(xì)胞存活率為51.3%，明顯高于出發(fā)菌的36.7%，這一情況在45 ℃時(shí)更加明顯，但由于改造菌本身的存活率也只有31.2%左右，故筆者在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，選擇較理想的高溫為40 ℃。

由圖4可知：當(dāng)在32 ℃下培養(yǎng)10 h，小于10%的發(fā)酵液乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌體的存活率影響較小，改造菌的存活率在0%和5%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)分別為99.5%和96.7%，與出發(fā)菌差別不大(同條件下為99.2%和91.5%)，但當(dāng)進(jìn)一步提升乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，其影響較大。尤其在20%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，改造菌的菌體存活率降低最多，為53.2%，但相比出發(fā)菌(24.8%)仍有很大的提高。

為了進(jìn)一步研究改造菌在高溫高乙醇下的耐受能力，筆者選擇在40 ℃(存活率高于50%)培養(yǎng)溫度下，依次改變乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，觀察菌株的生長性狀和菌體存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 40 ℃下不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 對菌株存活率的影響Fig.5 Influences of different ethanol concentrations on the survival rate of strains under 40 ℃

由圖5可知：40 ℃下培養(yǎng)時(shí)，即使在0%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，改造菌和出發(fā)菌的存活率均有較大的下降，分別為62.8%和43.1%，可見溫度對菌體的生理影響較為顯著。當(dāng)溫度聯(lián)合乙醇壓力共同作用菌體時(shí)，其破壞影響更為顯著，在20%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，這一對比最為明顯，改造菌和出發(fā)菌的菌體存活率分別為31.2%和2.1%，可以看出出發(fā)菌在高溫高乙醇的連續(xù)沖擊下，菌株存活率僅為2.1%，接近于0；而改造菌雖然已有較大的菌株死亡，但其菌株存活率仍維持在30%以上，其抗高溫高壓性能提升幅度明顯。

2.3 菌株S.cerevisiae YH+的代謝流量分析

圖6 釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The map of metabolic network of S.cerevisiae

通過代謝通量數(shù)據(jù)分析，得到出發(fā)菌和改造菌的代謝流分布數(shù)據(jù)表，結(jié)果如表7所示。

由表7可知：在14～15 h內(nèi)，改造菌株S.cerevisiaeYH+及對照菌株糖酵解途徑的通量r2均顯著大于磷酸戊糖途徑的通量r13，說明糖酵解依然是葡萄糖中心碳代謝的主要途徑；過表達(dá)基因sym1(類mpv17蛋白基因)和hsp104兩個(gè)熱休克家族蛋白關(guān)鍵基因，能強(qiáng)化r7、r8和r9的代謝流，并減少r10和r16代謝流，從而使碳代謝流向合成乙醇方向增加，增加合成乙醇的通量。

表7 改造菌與出發(fā)菌的代謝通量數(shù)據(jù)Table 7 Metabolic flux of modified bacteria and original bacteria

3 討 論

過表達(dá)基因sym1和hsp104，均為熱休克家族蛋白的關(guān)鍵基因，其單獨(dú)缺失均可增加細(xì)胞膜的通透性，并提高觸發(fā)高溫防御機(jī)制的敏感度[12-13]。研究表明：乙醇還會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)的線粒體，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，過表達(dá)熱激蛋白關(guān)鍵基因，可有效提高菌體的抗氧化能力，從而提高菌體的抗高質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇毒害能力，使細(xì)胞存活率在高溫高乙醇環(huán)境下保持理想水平[14-16]；改造菌可能在增加乙醇合成通量的過程中，為了維持菌體內(nèi)部的代謝穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)了耐乙醇毒害因子(具體的物質(zhì)需要后續(xù)通過實(shí)時(shí)的氣質(zhì)聯(lián)用檢測系統(tǒng)對其液態(tài)與氣態(tài)發(fā)酵成分進(jìn)行檢測確定)的合成與反饋調(diào)節(jié)[17]；據(jù)劉月芹[18]文獻(xiàn)報(bào)道，耐高溫高乙醇能力強(qiáng)的菌株，具有有較好的細(xì)胞壁完整性、較高的海藻糖積累量、較強(qiáng)的抗氧化性、乙醇耐受性和能量代謝等特點(diǎn)。

通過代謝流量分析，過表達(dá)基因sym1(類mpv17蛋白基因)和hsp104兩個(gè)熱休克家族蛋白關(guān)鍵基因，可以增加合成乙醇的關(guān)鍵途徑r7,r8和r9的反應(yīng)，并抑制消耗合成乙醇前提物Pyr(丙酮酸)和Aca(乙醛)的r10和r16的反應(yīng)，從而增加乙醇的合成量。其中，r7為PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)到Pyr(丙酮酸)途徑，r8為Pyr(丙酮酸)到Aca(乙醛)途徑，r9為Aca(乙醛)到Eth(乙醇)途徑；r10為Aca(乙醛)到NADPH途徑，r16為Pyr(丙酮酸)到乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)的途徑。整體上刺激碳代謝流向合成乙醇方向增加，增加合成乙醇的通量。

4 結(jié) 論

采用分子生物學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)分析等手段，優(yōu)化整合釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)，通過過表達(dá)關(guān)鍵基因sym1和hsp104，強(qiáng)化熱休克蛋白的表達(dá)，使出發(fā)菌釀酒酵母的耐乙醇能力顯著提升，最終使改造菌在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，40 ℃發(fā)酵溫度的條件下，能夠保持接近35%的細(xì)胞存活率，在同等條件下，出發(fā)菌株的存活率僅為2.1%。本研究將為后續(xù)的耐乙醇釀酒酵母工程菌的開發(fā)提供參考價(jià)值，但是仍存在一些不足之處，比如未能將質(zhì)粒過表達(dá)的形式轉(zhuǎn)化為染色體基因組整合，這樣會(huì)使改造菌性能更穩(wěn)定，另外對基因sym1和hsp104的強(qiáng)化表達(dá)與增加改造菌抗高溫高藝純的能力之間的深層機(jī)理未做過多探究，這些都需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)工作中著重探討。