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    不同短鏈脂肪酸對(duì)高山被孢霉生物合成ARA的影響

    2020-04-16 03:23:22李悅明徐洪清徐建春逄瑞蓮徐炳政
    發(fā)酵科技通訊 2020年1期
    關(guān)鍵詞:孢霉戊酸丙酸

    李悅明,徐洪清,徐建春,逄瑞蓮,徐炳政

    (1.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司,山東 青島 266400;2.青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,山東 青島 266400;3.青島西海岸新區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局,山東 青島 266400)

    花生四烯酸(Arachidonic acid,簡(jiǎn)稱ARA),屬于ω-6系列的多不飽和脂肪酸,在體內(nèi)發(fā)揮多種生物功能,它不僅作為一種極其重要的結(jié)構(gòu)脂類廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上,而且是人體前列腺素、血栓素和白三烯等活性物質(zhì)合成的前體物質(zhì)。因其功能的多樣性,ARA已在保健食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。長(zhǎng)期以來(lái),ARA的主要來(lái)源是動(dòng)物肝臟、魚油和豬腎上腺等動(dòng)物組織,但動(dòng)物組織中ARA含量低且來(lái)源有限,不能滿足市場(chǎng)的需要。微生物法生產(chǎn)ARA具有發(fā)酵周期短、不受季節(jié)和來(lái)源限制等特點(diǎn),受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。目前,高山被孢霉已經(jīng)成為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)ARA的最佳菌株,然而,產(chǎn)量低和成本高仍然是利用高山被孢霉大規(guī)模生產(chǎn)ARA的瓶頸。因此提高ARA在培養(yǎng)過(guò)程中的生產(chǎn)效率,成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3,5]。

    直鏈或支鏈羧酸,包括短鏈脂肪酸(SCFA,Short-chain fatty acid)如乙酸、丙酸、丁酸等,可以提供?;o酶A作為脂肪酸合成的起始單元[4],而用于脂肪酸生物合成的還原力——NADPH的產(chǎn)生則主要取決于蘋果酸酶(ME,Malic enzyme)[7]。研究表明SCFA可以被某些海藻利用[6-8]。筆者研究了包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸(2-甲基丙酸)、戊酸和異戊酸(3-甲基丁酸)在內(nèi)的6種不同SCFAs對(duì)高山被孢霉中油脂積累和脂肪酸生物合成的影響。發(fā)酵過(guò)程中,將6種SCFAs分別加入不同實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基中,嘗試提供各種?;鵆oA底物,通過(guò)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)不同階段細(xì)胞生長(zhǎng)速率差異、脂肪酸組成和ME活性的變化研究高山被孢霉中ARA生物合成的代謝調(diào)控機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與培養(yǎng)條件

    實(shí)驗(yàn)菌株為高山被孢霉LYT22(MortierellaalpinaLYT22),此菌株由野生型菌株高山被孢霉M32222菌株誘變而來(lái),由筆者公司自行保存。

    PDA培養(yǎng)基1 L:土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g(用于平板保存)。

    種子培養(yǎng)基1 L:葡萄糖30 g,酵母提取物6 g,KH2PO43 g,NaNO32.8 g,MgSO4·7H2O 0.5 g。

    發(fā)酵培養(yǎng)基1 L:葡萄糖80 g,酵母提取物11 g,蛋白胨10 g,檸檬酸三鈉鹽2 g,KH2PO43.8 g,NaNO33.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g。

    乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、三氯甲烷:分析純,購(gòu)于青島精科儀器試劑有限公司。

    種子在25 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)3 d,然后按V(種子量)∶V(發(fā)酵量)=1∶10接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d。分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是在5 L Biostat?B發(fā)酵罐中進(jìn)行,配有pH、溫度、攪拌和溶解氧質(zhì)量濃度(DO)傳感器。初始裝填3 L發(fā)酵培養(yǎng)基,在固定的4.5 L/min氣流速率下自動(dòng)調(diào)節(jié)攪拌速度為200~500 r/min,使DO保持在20%以上。利用m(葡萄糖)∶V(補(bǔ)料液)=3 g∶10 L的葡萄糖溶液作為補(bǔ)料培養(yǎng)基流加至培養(yǎng)基中,將葡萄糖質(zhì)量濃度維持在10~15 g/L,在排氣口增加水冷系統(tǒng),以減少蒸發(fā)。

    在此發(fā)酵條件下,培養(yǎng)基的pH逐漸升高,因此將乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸或戊酸中的一種短鏈脂肪酸作為pH調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基,將pH控制在6.5,在對(duì)照組中添加3 mol/L HCl,保持pH值為6.5。由于某些SCFA(例如丁酸和戊酸)具有強(qiáng)烈的刺激性氣味,因此所有實(shí)驗(yàn)均在通風(fēng)室內(nèi)進(jìn)行,并且排出尾氣先經(jīng)5 mol/L NaOH溶液吸收,然后再經(jīng)過(guò)填充滿活性炭的柱子吸附后,排放到環(huán)境。

    1.2 生物量測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)中生物量以干細(xì)胞質(zhì)量(DCW)表示。將細(xì)胞懸浮液的樣品(30 mL)在7 000g和4 ℃條件下離心10 min,用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次,將細(xì)胞沉淀,在-50 ℃條件下冷凍干燥至恒重。

    1.3 脂質(zhì)提取與脂肪酸分析

    使用改良的Bligh-Dyer算法計(jì)算總脂質(zhì)含量[9]。室溫下,將干燥的細(xì)胞提取到10 mL氯仿甲醇混合液(V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1)中,用無(wú)水Na2SO4干燥脂質(zhì)提取物,通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑,稱重計(jì)算總脂質(zhì)。將提取的脂質(zhì)約10 mg溶解在1 mL氯仿中,加入3 mL硫酸-甲醇溶液(V(硫酸)∶V(甲醇)=2∶100),85 ℃下孵育150 min,獲得脂肪酸甲酯(FAME)。脂肪酸甲酯(FAME)用正己烷萃取,采用氣相色譜法(GC)測(cè)定。使用HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱分離FAME。柱箱初始溫度設(shè)置為100 ℃,持續(xù)1 min,然后以15 ℃/min的速度升至250 ℃,保持5 min。分流比為V(進(jìn)樣)∶V(分流)=1∶19,用氮?dú)庾鬏d氣,使用氫火焰離子檢測(cè)器(FID)進(jìn)行檢驗(yàn),進(jìn)樣口和火焰離子化口的溫度為260 ℃,進(jìn)樣量為1 μL。

    1.4 細(xì)胞裂解液制備

    為了制備用于酶活測(cè)定的細(xì)胞提取物,將收獲的菌體以7 000g離心,先用4 ℃的蒸餾水洗滌沉淀物,然后用洗滌緩沖液(400 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 7.4,m(甘油)∶V(水)=20 g∶100 L,1 mmol/L 二硫赤蘚糖醇(DTT))洗滌并懸浮。在60 MPa下通過(guò)細(xì)胞破碎儀(Constant systems)將細(xì)胞裂解,裂解液在4 ℃下10 000g離心10 min,將上清液立即用于測(cè)定ME活性。使用Bradford方法以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

    1.5 NADP+依賴的蘋果酸酶酶活分析

    在60 MPa下通過(guò)細(xì)胞破碎儀(Constant Systems)將細(xì)胞裂解,將裂解液在4 ℃下10 000g離心10 min,將上清液立即用于測(cè)定ME活性。使用Bradford方法以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)分光光度法監(jiān)測(cè)25 ℃下NADPH的形成速率進(jìn)行蘋果酸酶的活性[10]測(cè)定。反應(yīng)在包含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、0.5 mmol/L NADP+、20 mmol/L L-蘋果酸鹽和10 mmol/L MgCl2的1.0 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行。酶活性(U)的單位定義為每分鐘NADPH的增加量,以O(shè)D340增加0.001/min表示。比活性定義為U/mg蛋白。

    1.6 葡萄糖濃度分析

    每4 h從發(fā)酵罐中取出25 mL樣品,通過(guò)配備有葡萄糖氧化酶電極的生物傳感器(SBA-40E,山東省科學(xué)院生物研究所)對(duì)殘留的葡萄糖進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果分析

    2.1 短鏈脂肪酸對(duì)被孢霉細(xì)胞生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的影響

    在發(fā)酵過(guò)程中,各實(shí)驗(yàn)組以pH調(diào)控的方式分別加入乙酸354 mL、丙酸261 mL、異丁酸124 mL、丁酸153 mL、異戊酸85 mL或戊酸89 mL,對(duì)照組以鹽酸調(diào)控pH。發(fā)酵結(jié)束時(shí),發(fā)酵液中沒(méi)有或只有少量的短鏈脂肪酸檢測(cè)到,表明本研究中所有測(cè)試的短鏈脂肪酸均可被高山被孢霉充分利用。發(fā)酵結(jié)束后的生物量、總葡萄糖消耗量、總酸消耗量和碳轉(zhuǎn)化率如表1所示。

    表1 短鏈脂肪酸對(duì)生物量、葡萄糖消耗、酸消耗和 碳轉(zhuǎn)化率的影響(總體積為3.5 L)

    注:碳的總摩爾數(shù)是葡萄糖消耗中的碳摩爾數(shù)與酸消耗中的碳摩爾數(shù)之和。

    添加短鏈脂肪酸時(shí),總葡萄糖消耗量相應(yīng)減少,同時(shí),每mol碳到生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率也因添加短鏈脂肪酸的不同而發(fā)生變化:加入乙酸和丙酸時(shí),細(xì)胞內(nèi)油脂含量增加使碳轉(zhuǎn)化率從9.7 g/mol降低到約7.3 g/mol,加入丁酸、戊酸后,被孢霉油脂積累受到抑制,碳轉(zhuǎn)化率逐漸恢復(fù)至9.0 g/mol。

    向發(fā)酵體系中流加入各種短鏈脂肪酸時(shí),乙酸和丙酸不影響被孢霉的正常生長(zhǎng),總生物量分別達(dá)到53.9 g/L和52.2 g/L,與對(duì)照組相仿。但隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加,短鏈脂肪酸的毒性逐漸增加,被孢霉的生長(zhǎng)逐步受到影響,生物量減少,向培養(yǎng)基中加入戊酸時(shí),被孢霉生物量只有37.8 g/L,僅為對(duì)照組的75.6%,如圖1(a)所示;短鏈脂肪酸也對(duì)高山被孢霉脂質(zhì)的蓄積產(chǎn)生了顯著的影響,如圖1(b)所示。發(fā)酵3 d后,對(duì)照組、乙酸組和丙酸組細(xì)胞進(jìn)入脂質(zhì)快速蓄積時(shí)期,其他實(shí)驗(yàn)組的脂質(zhì)蓄積受到了抑制,蓄積速率顯著低于前三者。發(fā)酵結(jié)束時(shí),乙酸組和丙酸組的脂質(zhì)質(zhì)量分別為細(xì)胞干質(zhì)量的46.8%和40.8%,高于對(duì)照組的37.4%,這是由于體系中的乙酸和丙酸不僅可以作為被孢霉生長(zhǎng)的碳源,也可以直接為細(xì)胞中脂肪酸合成提供底物,從而促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)的積累[11-12];丁酸和戊酸組的脂質(zhì)含量顯著降低,其中戊酸處理組中脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為25.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著短鏈脂肪酸中碳鏈的增長(zhǎng),被孢霉細(xì)胞脂質(zhì)的積累受到明顯抑制并急劇減少。

    圖1 短鏈脂肪酸對(duì)高山被孢霉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng) 和脂質(zhì)積累的影響Fig.1 Effects of short chain fatty acids on cell growth and lipid accumulation during fermentation of Mortierella alpina

    已有研究結(jié)果證實(shí)蘋果酸酶是脂質(zhì)生物合成中為脂肪酸合酶提供NADPH的關(guān)鍵酶,其他NADPH產(chǎn)生酶,例如NADP+依賴性異檸檬酸脫氫酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶僅對(duì)脂質(zhì)積累過(guò)程中NADPH的供應(yīng)起輕微作用[13-14]。為了表征本研究中NADPH的生成,筆者檢測(cè)了所有實(shí)驗(yàn)組中蘋果酸酶的活性,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 短鏈脂肪酸對(duì)被孢霉中蘋果酸酶活性的影響Fig.2 The effect of short chain fatty acids on the activity of malic acid enzyme in Mortierella sp.

    由圖2可知:除了戊酸和異戊酸處理組外,其他組中的蘋果酸酶活性均具有相似的變化趨勢(shì),在早期脂質(zhì)積累階段(發(fā)酵前3 d),脂質(zhì)積累很慢,所有ME活性均低于110 U/mg;隨后,在脂質(zhì)快速合成階段(4~6 d),ME活性迅速增加到250 U/mg以上,促使細(xì)胞中大量脂質(zhì)積聚;在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,戊酸處理組的ME活性均低于70 U/mg,表明NADPH供應(yīng)不足,最終導(dǎo)致脂質(zhì)在細(xì)胞中的積累很少。

    2.2 短鏈脂肪酸對(duì)被孢霉脂肪酸組成的影響

    添加短鏈脂肪酸使高山被孢霉的脂肪酸組成產(chǎn)生了顯著變化。發(fā)酵過(guò)程中高山被孢霉脂肪酸的主要變化如圖3所示,發(fā)酵結(jié)束時(shí)各組菌株的脂肪酸組成如表2所示。

    圖3 發(fā)酵過(guò)程中被孢霉脂肪酸組成的主要變化Fig.3 Major changes in fatty acid composition of Mortierella during fermentation

    表2 發(fā)酵結(jié)束后各實(shí)驗(yàn)組高山被孢霉的脂肪酸組成
    Table 2 Fatty acid composition ofMortierellaalpinain each experimental group after fermentation

    脂肪酸脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%對(duì)照組乙酸丙酸丁酸異丁酸戊酸異戊酸C14:01.4401.4471.1801.6752.6020.3040.794C15:00.6930.69313.2240.8971.6137.4794.516C16:020.6599.5595.43716.62714.0909.03915.741C17:00.2800.2585.5760.3300.88810.9423.316C18:015.21710.6907.91018.74123.69313.38115.285C18:112.96511.56910.59111.47111.89310.68111.385C18:27.2268.9446.3438.3387.15110.4269.043C18:38.1588.2175.4867.8526.83910.1298.487C20:00.3110.5100.5890.1810.1510.2110.170C20:30.2250.2170.2680.3050.1610.0860.386C20:4(n-6,ARA)32.29847.29842.26732.80830.06426.16829.772C22:00.3150.2300.3680.2200.3050.2550.323

    由圖3可知:當(dāng)添加的脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度較短時(shí)(如乙酸、丙酸),細(xì)胞中可用于脂肪酸合成的還原力NADPH大量增加,促使脂肪酸合成向末端進(jìn)行,細(xì)胞中花生四烯酸(ARA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,分別達(dá)到總脂肪酸質(zhì)量的47.3%和42.2%。

    當(dāng)將奇碳鏈脂肪酸(丙酸、戊酸)加入培養(yǎng)基中時(shí),脂肪酸組成發(fā)生了巨大變化。補(bǔ)充丙酸后,細(xì)胞脂肪酸中奇數(shù)鏈脂肪酸(十五酸、C15:0、十七酸、C17:0)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇增加,尤其是十五碳酸,可以達(dá)到總脂肪酸質(zhì)量的13%以上。此現(xiàn)象可能是由于被孢霉細(xì)胞將丙酸轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A并隨后被脂肪酸合酶利用所致[15-16]。在戊酸處理組中,十七酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著高于其他組,達(dá)到10%左右。

    此外,筆者還檢測(cè)了戊酸處理對(duì)被孢霉脂質(zhì)積累影響過(guò)程的沖擊可逆性。實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵3 d時(shí)停止添加戊酸,改用流加HCl控制pH,結(jié)果如圖4(a,b)所示。

    圖4 戊酸對(duì)被孢霉發(fā)酵過(guò)程中脂質(zhì)積累和蘋果酶活性的可逆影響Fig.4 Reversible effects of valeric acid on lipid accumulation and malic enzyme activity during fermentation of Mortierella

    由圖4可知:消除戊酸壓力后,ME活性迅速增加至220.94 U/mg,4 d時(shí)被孢霉脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為14.42%,到發(fā)酵結(jié)束時(shí)脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升32%,說(shuō)明去除戊酸脅迫后,被孢霉細(xì)胞活性得以恢復(fù),ME活性的增加迅速增強(qiáng)了脂質(zhì)蓄積。

    3 結(jié) 論

    乙酸和丙酸不影響被孢霉的生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累,添加乙酸時(shí)生物量和油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高分別可達(dá)到53.9 g/L和46.8%。隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加,短鏈脂肪酸的毒性逐漸增加,被孢霉的生長(zhǎng)逐步受到影響,導(dǎo)致油脂積累減少;酶活分析結(jié)果證實(shí)蘋果酸酶的活性與細(xì)胞中脂質(zhì)的積累量呈正相關(guān)關(guān)系,當(dāng)把奇碳鏈脂肪酸(丙酸、戊酸)加入培養(yǎng)基中時(shí),細(xì)胞中奇數(shù)鏈脂肪酸(十五酸和十七酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提升,最高可以達(dá)到總脂肪酸質(zhì)量的10%以上;此外,研究還證明了山被孢霉的影響是可逆的,移除脅迫后細(xì)胞生長(zhǎng)可以恢復(fù)。

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