梔子豉湯鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制研究※

康 璐，劉 倩，劉玉曄，指導(dǎo)老師：崔書克

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008)

失眠是臨床常見的睡眠障礙性疾病，調(diào)查顯示，全球失眠的發(fā)病率為28%，中國成年人失眠發(fā)病率達(dá)38.2%，超過3億中國人有睡眠障礙[1]。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，社會越來越多元化，復(fù)雜的社會生態(tài)和老齡化日益加劇都影響著人們的心身健康，失眠患病率日益增加。因此研究失眠的病因病機(jī)和治療，具有重要意義。

梔子豉湯出自《傷寒雜病論》第76條：“發(fā)汗后，水藥不得入口，為逆，若更發(fā)汗，必吐下不止。發(fā)汗吐下后，虛煩不得眠，若劇者，必反復(fù)顛倒，心中懊，梔子豉湯主之。”梔子豉湯由炒梔子、淡豆豉組成，梔子苦寒，清透郁熱，解郁除煩，可導(dǎo)熱下行；淡豆豉氣味俱輕，既能透表宣郁，又可和降胃氣[2]；兩藥配伍，清中有宣，宣中有降，共奏清宣郁熱之效。此方藥簡效宏，是治療熱郁胸膈不寐的經(jīng)方?，F(xiàn)代研究表明，梔子中的主要活性成分環(huán)烯醚萜苷類具有抗炎、抗氧化、降血脂，改善失眠、焦慮、抑郁癥狀等多種藥理作用[3]。目前，關(guān)于梔子豉湯鎮(zhèn)靜催眠作用的研究較少，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究梔子豉湯對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用，初步探討其在鎮(zhèn)靜催眠方面的作用機(jī)制。

1 研究材料

1.1 儀器 恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造公司，HH-6數(shù)顯恒溫)；電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司，型號：MP6001]；微量臺式高速離心機(jī)(Cat.No：911115110000)；BioTek酶標(biāo)儀(美國，BioTek Instruments，Inc)；Nikon80i生物顯微鏡攝像系統(tǒng)(日本，尼康公司)。

1.2 試劑與藥材 炒梔子、淡豆豉由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定；天王補(bǔ)心丹(蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：1811071，36 g/瓶)；氯化鈉注射液(河南科倫藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：A18013101-2)；戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS：57-33-0，生產(chǎn)批號：TP20160910，25 g/瓶)；去甲腎上腺素(NE)ELISA檢測試劑盒(生產(chǎn)批號：CK-E91494M)；5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號：CK-E91467M)。試劑盒均為南京建成生物工程研究所有限公司提供。

2 研究方法

2.1 藥物制備 梔子豉湯在《傷寒雜病論》中描述為“梔子十四枚，擘香豉四合，綿裹；上兩味，以水四升，先煮梔子，得兩升半，內(nèi)豉，煮取一升半，去滓，分為二服，溫進(jìn)一服，得吐者，止后服”。根據(jù)現(xiàn)代臨床應(yīng)用劑量折算為炒梔子9 g，淡豆豉4 g。本實(shí)驗(yàn)選用炒梔子45 g，淡豆豉20 g，熬制時(shí)先將炒梔子放入2 000 m L水中，煮至1 250 m L后加入淡豆豉，最后濃縮至313 m L(1 m L藥液中約含有生藥0.208 g)。取2份適宜劑量原液，用蒸餾水分別稀釋到25%、50%，與原液分別組成梔子豉湯低、中、高劑量組，冰箱-4℃保存。將天王補(bǔ)心丸配制成濃度為0.1 g/m L的水溶液。將戊巴比妥鈉配制成濃度為0.3%的氯化鈉溶液。

3 觀察指標(biāo)與結(jié)果

3.1 小鼠狀態(tài)觀察 觀察每組小鼠的飲食、排便、體質(zhì)量、精神和活動情況等一般狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)死亡率?？瞻讓φ战M和梔子豉湯低劑量組實(shí)驗(yàn)過程中各死亡1只。

3.2 記錄翻正反射消失時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間 最后1次灌胃給藥1 h后，進(jìn)行鎮(zhèn)靜催眠實(shí)驗(yàn)。腹腔注射已配制的戊巴比妥鈉溶液，按每只45 mg/kg的劑量給藥，密切觀察并詳細(xì)記錄小鼠的翻正反射消失時(shí)間(從給小鼠注射戊巴比妥鈉到小鼠無法自主翻身的時(shí)間)及其睡眠持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)在室溫(25±2)℃、通風(fēng)、安靜條件下進(jìn)行，不可對睡眠小鼠有任何人為干預(yù)幫助蘇醒。

3.3 小鼠腦組織NE、5-HIAA檢測 第7日藥物灌胃24 h后斷頭處死小鼠，在冰上立即取出腦組織，用氯化鈉注射液輕輕沖洗，去除血跡，然后放在濾紙上，快速將水吸干凈。精密稱重，用錫箔包裹，儲存在-80℃冰箱中，待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定小鼠腦組織中NE、5-HIAA的含量。測定步驟如下：室溫環(huán)境中把試劑盒均衡20 min以后，從鋁箔袋中取出實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)目；設(shè)置好標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，其中R為空白孔；樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，裝進(jìn)原來的鋁箔袋中，用保鮮膜纏裹，放在37℃的水浴鍋中溫育60 min；把包裹住的板條拿出來，迅速翻轉(zhuǎn)倒出孔中液體，并用吸水紙吸干，每孔用洗滌液滴滿，1 min后迅速翻轉(zhuǎn)倒出洗滌液，用吸水紙吸干，重復(fù)此過程5次；把底物A、B分別滴至每個(gè)孔里，均滴加50μL，用封板膜封住板條，裝入鋁箔袋中，用保鮮膜包裹，在37℃的環(huán)境下避開光照，孵育15 min；然后取出板條，在每個(gè)孔中滴加50μL終止液，15 min內(nèi)在450 nm波長的酶標(biāo)儀里測定各孔的OD值，并將數(shù)據(jù)記錄保存。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。每組數(shù)據(jù)用單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.5 結(jié)果

(1)翻正反射消失時(shí)間、睡眠持續(xù)時(shí)間比較 與空白對照組比較，梔子豉湯高、中劑量組和天王補(bǔ)心丹組小鼠的翻正反射消失時(shí)間顯著縮短，梔子豉湯高、中劑量組、天王補(bǔ)心丹組小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；天王補(bǔ)心丹組與梔子豉湯高劑量組翻正反射消失時(shí)間、睡眠持續(xù)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 5組小鼠翻正反射消失時(shí)間、睡眠持續(xù)時(shí)間比較(x±s)

(2)NE、5-HIAA含量比較 與空白對照組比較，天王補(bǔ)心丹組、梔子豉湯中、高劑量組小鼠腦組織中的5-HIAA含量水平顯著升高(P＜0.05)，NE含量水平顯著降低(P＜0.05)；天王補(bǔ)心丹組與梔子豉湯高劑量組小鼠腦組織中的NE、5-HIAA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 5組小鼠腦組織中甲腎上腺素、5-羥吲哚乙酸的含量比較(ng/g，x±s)

4 討論

不寐是以經(jīng)常不能獲得正常睡眠為特征的一類病證，主要表現(xiàn)為睡眠時(shí)間及深度不足，輕者入睡困難，或寐而不酣，時(shí)寐時(shí)醒，或醒后不能再寐，重則徹夜不寐[4]。失眠在女性和老年人群中發(fā)病率較高，老年人失眠發(fā)病率為12%～25%，伴有生理、心理性疾病的老年人群發(fā)病率更高[2]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，年輕人也開始出現(xiàn)各種各樣的失眠問題，失眠患者普遍存在高發(fā)病率和高共患病性的特點(diǎn)[5]。長期失眠會導(dǎo)致記憶力減退、認(rèn)知能力下降，甚至誘發(fā)心腦血管及神經(jīng)性疾病[6]。西醫(yī)治療失眠主要以藥物和心理治療為主，鎮(zhèn)靜催眠藥物不良反應(yīng)明顯，心理療法也有一定局限性。中醫(yī)藥治療失眠，具有療效好、安全性高、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢。

梔子豉湯用于治療熱郁胸膈、虛煩不得眠之證，由梔子和淡豆豉兩味藥物組成。梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦性寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功，善清三焦火邪，瀉心火而除煩，為治熱病心煩、燥擾不寧之要藥?！睹t(yī)別錄》謂其可療“胸心、大小腸大熱，心中煩悶”。《本草衍義》云：“梔子雖寒無毒，治胃中熱氣，既亡血、亡津液，腑臟無潤養(yǎng)，內(nèi)生虛熱，非此物不可去。”現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梔子具有鎮(zhèn)靜作用，加熱炮制后鎮(zhèn)靜作用增強(qiáng)[7]?！侗静輳男隆分^豆豉：“苦瀉肺，寒勝熱，發(fā)汗解肌，調(diào)中下氣，治傷寒寒熱頭痛，煩躁滿悶，懊不眠，發(fā)斑嘔逆?！薄侗静菀鬃x》云豆豉：“調(diào)中下氣，除煩止嘔。”兩藥合用，清中有宣，宣中有降，互濟(jì)互用，為輕宣胸中郁熱，治虛煩懊不眠之良方[3]。

天王補(bǔ)心丹為安神劑，現(xiàn)代臨床常用于治療神經(jīng)衰弱、心臟病、精神分裂等所致的失眠、心悸證[8]。目前，對于天王補(bǔ)心丹的臨床應(yīng)用及藥理藥效研究比較成熟，其治療失眠多慮的療效良好，故本實(shí)驗(yàn)將其作為梔子豉湯的對照品。

NE是維持睡眠覺醒的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在腦組織中的海馬體、丘腦等部位含量較高，通過促進(jìn)神經(jīng)元興奮達(dá)到維持覺醒的目的。失眠與大腦中的NE含量升高密切相關(guān)，研究表明，藥物可通過降低腦組織中NE水平，抑制其維持覺醒的作用[9]。5-羥色胺(5-HT)生成的無活性酸性代謝終產(chǎn)物可間接反映5-HT的變化，5-HT為失眠的重要參考指標(biāo)。如在抑郁癥失眠模型動物的腦組織中，5-HT與5-HIAA均有所下降[10]，動物被剝奪睡眠后，其腦組織內(nèi)海馬、下丘腦的5-HIAA與5-HT的比值上升，提示失眠能使腦中5-HT的代謝率升高。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，梔子豉湯高、中劑量組和天王補(bǔ)心丹組小鼠的翻正反射消失時(shí)間顯著縮短(P＜0.05)，梔子豉湯高、中劑量組、天王補(bǔ)心丹組小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間延長(P＜0.05)，且小鼠腦組織中的5-HIAA含量水平顯著升高(P＜0.05)，NE含量水平顯著降低(P＜0.05)；天王補(bǔ)心丹組與梔子豉湯高劑量組翻正反射消失時(shí)間、睡眠持續(xù)時(shí)間及小鼠腦組織中的NE、5-HIAA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明梔子豉湯與天王補(bǔ)心丹均有鎮(zhèn)靜催眠作用，能與戊巴比妥鈉產(chǎn)生協(xié)同作用，縮短小鼠翻正反射消失時(shí)間，延長小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間，且高劑量組效果更明顯，這與張仲景利用其治療“虛煩不得眠”一致；且提示梔子豉湯能在一定程度上降低小鼠腦組織海馬、下丘腦中NE的含量，降低腦部神經(jīng)元的興奮性，降低其維持覺醒的綜合能力。5-HIAA的含量升高，可能與5-HT代謝增多有關(guān)。梔子豉湯低劑量組小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間略高于空白對照組小鼠，但無明顯差異，且小鼠腦組織中NE、5-HIAA含量并無明顯變化，可能因?yàn)闂d子豉湯劑量過低，在有限的給藥期間未產(chǎn)生相應(yīng)的藥理作用。

綜上所述，梔子豉湯對小鼠有鎮(zhèn)靜催眠作用。梔子豉湯高劑量組作用效果最佳，其機(jī)制可能與神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-HIAA有關(guān)，符合鎮(zhèn)靜催眠小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況[11]。本研究為梔子豉湯抗焦慮、抑郁和治療失眠的臨床藥理學(xué)研究做了一定補(bǔ)充，但梔子豉湯的鎮(zhèn)靜催眠作用對小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的具體影響，需要進(jìn)一步探討及研究。