柚皮素磷脂復(fù)合物對實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管NF-κB/iNOS 通路的影響

吉潔，徐新榮，周春剛，唐苗苗，唐穎，王榮榮，王科蕾

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是較為常見的眼底病變，CNV 的發(fā)病因素較為復(fù)雜，可能與Bruch’s 膜的損傷、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞外基質(zhì)變化、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1]。目前關(guān)于CNV 的形成機(jī)制對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的研究較多[2]。近年來研究表明，核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)在新生血管形成中具有重要作用，其可調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管形成因子、黏附因子等細(xì)胞因子[3]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）與新生血管的形成具有密切的聯(lián)系，而iNOS 表達(dá)的機(jī)制是通過抑制NF-κB 的活化抑制iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平[4]。目前對CNV 的治療主要是糖皮質(zhì)激素和VEGF 拮抗劑，但這兩類藥物存在高風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用昂貴等限制，因此尋找治療CNV 的藥物具有重要臨床意義。關(guān)于許多中藥單體能明顯抑制眼新生血管生成已有許多相關(guān)報(bào)道[5]。柚皮素（naringenin，Nar）是二氫黃酮類植物提取物，具有抑制iNOS、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)的作用，但其水溶性差，生物利用率低[6]。故本研究采用柚皮素磷脂復(fù)合物（naringin phospholipid complex，NPC）治療CNV 大鼠，探究其對CNV 大鼠NF-κB/iNOS 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 清潔級健康雄性Brown-Norway 大鼠72 只購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2015-0012]，體重200～220 g，嚴(yán)格按照飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)大鼠，室內(nèi)保持通風(fēng)，溫度25℃，濕度50%，光照時間為12 h（8：00～20:00），大鼠自由飲用蒸餾水，飼養(yǎng)期間保持飼養(yǎng)房間整潔。

1.2 儀器與試劑

柚皮素（北京百靈威科技有限公司）純度＞98%，大豆磷脂（上海浦江磷脂廠），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）（SIGMA 公司）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）（SIGMA公司）、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6（interleukin-6，IL-6)ELISA 試劑盒（美國Abcam 公司），NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF 兔抗鼠一抗（美國R&D 公司）；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗、β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）；蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司），RIPA 裂解液、BCA 測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；多波長氪激光機(jī)（美國Lumenis 醫(yī)療激光公司）；X 射線衍射儀（瑞士ARL 公司）；熒光定量PCR 儀（美國BioRed 公司）；光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss）；凝膠成像儀（購自于美國GE公司）；ImageJ 軟件（USANationalInstitutes of Health）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠SAH 模型制備 大鼠在造模前禁食12 h，腹腔注射10% 水合氯醛（0.3 ml/kg）麻醉動物，用0.5%托吡卡胺與新福林混合散瞳劑充分散瞳孔，采用氪黃激光（波長568 nm，參數(shù)：光斑直徑100 μm，曝光時間0.1 s,功率150～200 mW，在120 D 專用前置鏡下，距視盤2～4 個視盤直徑，圍繞視盤在視網(wǎng)膜大血管間光凝8 個點(diǎn)，光凝后待Bruch’s 膜被擊破后產(chǎn)生小氣泡視為合格光凝點(diǎn)，將視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜或玻璃體出血大鼠剔除，造模成功大鼠麻醉蘇醒后送回SPF 飼養(yǎng)箱。

1.3.2 藥品制備 柚皮素（Nar）溶于無水乙醇中，加溫至60℃，按照1:2 的質(zhì)量比加入大豆磷脂攪拌均勻成溶液狀態(tài)，過濾溶液，濾液經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥24 h 的柚皮素磷脂復(fù)合物（NPC）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 模型大鼠隨機(jī)分為空白對照組12 只，溶媒對照組12 只、Nar 治療組12 只、NPC治療組36 只（分高、中、低三個濃度組），Nar 治療組給藥劑量：20 mg/kg/d，NPC 治療組按高、中、低3 個劑量（10、20、30 mg/kg/d）分別給藥；溶媒對照組給Nar治療組藥液等體積二甲基亞砜（DMSO）。均為腹腔注射。視網(wǎng)膜光凝后當(dāng)天開始給藥至觀察結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 眼底檢查和分析 于大鼠激光治療4 周后行眼底熒光造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA），每組12 只大鼠進(jìn)行麻醉、散瞳孔，舌下靜脈注射0.3ml的100 g/L 的熒光素鈉進(jìn)行眼底血管熒光造影檢查，立即開始雙眼攝片，觀察15 min，觀察CNV 形成情況，并計(jì)算熒光素滲漏點(diǎn)數(shù)占總光凝點(diǎn)數(shù)的百分率，評估CNV 的形成率。CNV 的評判標(biāo)準(zhǔn)：光凝點(diǎn)早期低熒光、晚期熒光素滲漏范圍擴(kuò)大為1 級，光凝點(diǎn)早期強(qiáng)熒光、晚期熒光素滲漏范圍擴(kuò)大為2 級。

1.4.2 脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微鏡觀察 給藥治療4 周后，每組取6 只大鼠進(jìn)行舌下靜脈注射異硫氰酸葡聚糖(FITC-D)（0.2 ml/只），100 mg FITC-D 溶于1 ml的PBS 緩沖液中。灌注完成30 min 后摘除大鼠眼球于4%的多聚甲醛溶液中固定1 h；顯微鏡下沿赤道部打開眼球，去除前節(jié)，揭除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，獲得視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體標(biāo)本，以視神經(jīng)為中心做4～6 個放射狀切口，常規(guī)梯度進(jìn)行乙醇脫水、二甲苯透明，隨后將RPE 面向下置于蓋玻片上，封片、烤片。標(biāo)本置于熒光顯微鏡光鏡下觀察、拍片并使用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4.3 RT-qPCR 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá) 參照RNA 提取試劑盒說明書提取眼后節(jié)組織（視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、RPE、脈絡(luò)膜復(fù)合物）總RNA，組織勻漿快速抽提，測定RNA的濃度和純度；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR。RT-qPCR 反應(yīng)體系：10×cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.5μL，H208μL，2×SYBR Mix 10 μL；RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃×3min，95℃×10s、60℃×30s，72℃×2 min，40 個循環(huán)，72℃延伸10 min。RT-PCR 引物由上海生工生物合成，序列如表1。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，以β-actin 作為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt算法進(jìn)行相對定量分析。

1.4.4 Westernblot 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 取出超低溫冰箱保存的眼后節(jié)組織100 mg，加入1 ml RIPA 裂解液裂解組織，冰上放置30 min，振蕩離心后收集上清液，提取總蛋白；BCA 法測定蛋白濃度，記錄562 nm 處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度，變性蛋白；配制濃度為12%分離膠、5%濃縮膠，蛋白上樣量為50 μg，電壓設(shè)定在100 V 電泳，電泳完成后蛋白凝膠轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，用TBST 溶液清洗后5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 溶液清洗后，加入一抗，4℃過夜，TBST 洗膜3 次/5 min；TBST 清洗后加入二抗，室溫下孵育1 h，洗膜3 次/5 min，TBST 清洗后置于凝膠成像儀中ECL 顯影液顯影，觀察各組蛋白變化情況。以β-Actin 為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

表1 RT-PCR 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPC 對大鼠FFA 檢測結(jié)果的影響

健康BN 大鼠視網(wǎng)膜血管呈放射狀行走，光凝后可見明顯瘢痕，空白對照組，溶媒組顯示有強(qiáng)熒光滲漏，熒光素滲透面積分別擴(kuò)大180 點(diǎn)、175 點(diǎn)，占總光凝數(shù)192 點(diǎn)的93.75%、91.14%；Nar 組熒光信號減弱，滲透范圍擴(kuò)大161 點(diǎn)，占總光凝點(diǎn)數(shù)的83.8%，與空白對照組相比CNV 形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.454，P=0.000）；NPC 低、中、高劑量組較空白對照組熒光信號顯著減弱，滲透范圍分別為143 點(diǎn)、120 點(diǎn)、105 點(diǎn)，分別占總光凝數(shù)的74.47%、62.5%、54.68%，光凝4 周后CNV 形成率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.681、54.857、76.555，均P=0.000）。

2.2 NPC 對大鼠CNV 面積的影響

脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微鏡觀察造模后視乳頭周圍的光凝點(diǎn)與周圍的脈絡(luò)膜比較呈網(wǎng)狀高熒光斑，新生血管形成。由表結(jié)合圖片可見，光凝4 周后各組視網(wǎng)膜均可見CNV，表示造模成功。空白對照組、溶媒組新生血管面積最大（圖1A，1B），兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，Nar 組和NPC組CNV 面積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tnar=15.165，tNPC低=21.411，tNPC中=29.815，tNPC高=34.129，均P=0.000）；NPC 低、中、高三組組間比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.117，P=0.000）。高劑量組CNV 面積顯著小于低、中劑量組（tNPC低=8.275，PNPC低=0.000；tNPC中=3.529，PNPC中=0.002）。與Nar 組相比，NPC 低、中、高劑量組CNV 面積明顯減少（tNPC低=8.824，tNPC中=13.920，tNPC高=17.724，均P=0.000）。

圖1 大鼠FFA 檢測結(jié)果。1A 空白對照組；1B 溶媒組；1C Nar 組；1D NPC 低劑量組；1E NPC 中劑量組；1F NPC 高劑量組

2.3 NPC 對NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)的影響

與空白對照組相比，溶媒組NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；Nar 組COX-2、MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)水平與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tcox-2=10.824，tMMP-2=6.346，tMMP-9=14.710；均P=0.000）；NPC 低、中、高劑量三組組間在NF-κB、COX-2、VEGF mRNA 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FNF-κB=95.681，F(xiàn)cox-2=65.732，F(xiàn)VEGF=86.90，均P=0.000），NPC低劑量組NF-κB、iNOS、COX -2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平均較Nar 組降低（tNF-κB=9.824，tiNOS=6.824，tcox-2=9.357，tVEGF=5.824，tMMP-2=5.914，tMMP-9=4.560；均P=0.000），NPC 高劑量組NF-κB、VEGF mRNA 表達(dá)水平較低劑量組降低（tNF-κB=35.461，tVEGF=28.175，均P=0.000）。

圖2 大鼠CNV 面積的檢測。2A 空白對照組；2B 溶媒組；2C Nar組；2D NPC 低劑量組；2E NPC 中劑量組；2F NPC 高劑量組

表2 不同藥物處理后大鼠視網(wǎng)膜CNV 面積（×103μm2，n=6）

圖3 大鼠各基因mRNA 檢測結(jié)果。3A NF-κB；3B iNOS；3C COX-2；3D VEGF；3E MMP-2；3F MMP-9。1 空白對照組；2 溶媒組；3 Nar 組；4 NPC低劑量組；5 NPC 中劑量組；6 NPC 高劑量組。a 與空白對照組比較，P＜0.05；b 與Nar 組比較，P＜0.05；c與NPC 低劑量比較，P＜0.05

2.4 NPC 對NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，溶媒組NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；Nar 組6 種指標(biāo)蛋白表達(dá)水平與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tNF-κB=4.261，tiNOS=4.750，tcox-2=3.824，tVEGF=5.432，tMMP-2=3.376，tMMP-9=10.722；均P=0.000）；柚皮素磷脂復(fù)合物組低劑量組iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平與柚皮素組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tiNOS=12.117，tcox-2=3.227，tVEGF=5.972，tMMP-2=3.631，tMMP-9=4.932；均P=0.000），柚皮素磷脂復(fù)合物高劑量組COX-2、VEGF 蛋白表達(dá)水平較中劑量組降低（tcox-2=10.753，tVEGF=6.148，均P=0.000），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 Western blot 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。1 空白對照組；2 溶媒組；3 Nar 組；4 NPC 低劑量組；5 NPC 中劑量組；6 NPC 高劑量組

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相關(guān)因子蛋白檢測結(jié)果（±s，n=3）

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相關(guān)因子蛋白檢測結(jié)果（±s，n=3）

注：a 與溶媒組比較，P＜0.05；b 與Nar 組比較P＜0.05；c 與NPC 低劑量組比，P＜0.05；d 與NPC 中劑量組比較，P＜0.05

3 討論

柚皮素是廣泛存在于橘子、胡柚皮、檸檬、枳殼中的黃酮類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)決定了其在水中的溶解度較低，生物利用率低。研究報(bào)道天然黃酮類物質(zhì)與磷脂具有特殊的親和力，可在一定條件下形成復(fù)合物，并能增強(qiáng)母體的生物、藥理活性[7-8]。銀杏黃酮磷脂復(fù)合物以DMSO 為溶媒可顯著提高銀杏黃酮的溶解度，提高其對動脈粥樣硬化形成的抑制作用[9]。雙氯芬酸與磷脂形成復(fù)合物后在正辛烷-水中的分配系數(shù)高了約1 倍。淫羊藿黃酮磷脂復(fù)合物在正辛烷-水中的分配系數(shù)是藥物自身的4 倍，可顯著提高藥物生物利用度[10]。葛根素磷脂復(fù)合物的體外透皮滲透實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葛根素磷脂的復(fù)合物的1 h 滲透量顯著高于葛根素[11]。本研究采用腹腔注射柚皮素和柚皮素磷脂復(fù)合物改善CNV 大鼠脈絡(luò)膜新生血管生成情況，研究結(jié)果顯示柚皮素磷脂復(fù)合物治療組的CNV 面積和熒光滲透較柚皮素組均顯著降低，表明柚皮素磷脂復(fù)合物的生物活性較柚皮素顯著提高，可抑制CNV 的生成。

NF-κB 是生物體內(nèi)廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，其在血管形成中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用。NF-κB 在視網(wǎng)膜缺氧狀態(tài)時表達(dá)于視網(wǎng)膜內(nèi)核層的膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞核中[12]。年齡相關(guān)性黃斑病變和缺血性視網(wǎng)膜病變患者的CNV 均是由缺氧引起[13-15]。NF-κB 在CNV組織的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等視網(wǎng)膜顆粒層組織中表達(dá)增加[16]。NO 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移，增加血管的通透性，其在體內(nèi)由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化合成[17]。NOS 中的iNOS 與多種病理過程相關(guān)，NF-κB 活性增加可促使iNOS活性升高。iNOS 活性增高可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)，調(diào)控血管生成[18]。COX-2 是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的酶，其是VEGF 的上游因子之一，調(diào)控眼組織新生血管的形成[19]。敲除小鼠COX-2 基因，可以抑制氪激光誘導(dǎo)的CNV 中VEGF 的表達(dá)下調(diào)，這可能與MMPs 途徑的活性降低、VEGF-MMPs 系統(tǒng)受到抑制相關(guān)[20]。MMPs 在炎性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中活性增高或者異常高表達(dá)，引起炎性細(xì)胞浸潤、血腦屏障損傷等[21]。MMP-2 和MMP-9 參與基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞的移行，是CNV 形成、發(fā)展必不可少的因素。轉(zhuǎn)化生長因子-β 多肽抑制物可下調(diào)VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9 的表達(dá)抑制CNV 形成[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素及柚皮素磷脂復(fù)合物治療組 可 下 調(diào)NF-κB、iNOS、VEGF、COX -2、MMP -2、MMP-9 的表達(dá)，抑制新生血管的形成、減少CNV 面積和熒光滲透。研究顯示，柚皮素能夠降低NF-κB、COX-2、iNOS 的活性，下調(diào)VEGF 的表達(dá)，抑制新生血管的形成。推測柚皮素可能是利用其抗炎作用，下調(diào)NF-κB、COX-2 的活性，抑制iNOS、VEGF、MMPs 的表達(dá)，進(jìn)而抑制CNV 的形成。而柚皮素磷脂復(fù)合物治療組對NF-κB、iNOS、VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)的抑制作用優(yōu)于柚皮素組，柚皮素磷脂復(fù)合物治療組CNV 面積和熒光滲透顯著低于柚皮素治療組，提示可能是磷脂復(fù)合物改變柚皮素的生物利用度，增強(qiáng)了其對各組酶和細(xì)胞因子的抑制作用。

綜上所述，柚皮素磷脂復(fù)合物可抑制氪激光誘導(dǎo)的CNV 的形成，其可能通過NF-κB/iNOS 通路發(fā)揮作用。但本研究尚存在不足之處，對NF-κB/iNOS通路影響CNV 形成的具體作用機(jī)制未詳細(xì)探究。今后需將柚皮素磷脂復(fù)合物和抗VEGF 藥物進(jìn)行對照研究，對柚皮素磷脂復(fù)合物的抑制脈絡(luò)膜新生血管作用會產(chǎn)生更加明確的意義。