雞γ干擾素與補(bǔ)體C3d主要片段的串聯(lián)表達(dá)及活性測(cè)定①

牛明福 范逸文 杜夢(mèng)璇 鮑永毅 宮 強(qiáng) 侯 穎

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/河南省食品微生物生物工程技術(shù)中心,洛陽 471023)

干擾素(interferon，IFN)是一種具有廣譜抗病毒活性的蛋白[1]，具有抵抗感染和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[2]。雞IFN-γ(chicken IFNγ，chIFN-γ)是由Sekellick等[3]從有絲分裂原刺激的雞脾淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后Digby 等[4]也成功克隆了chIFN-γ基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，chIFN-γ具有與哺乳動(dòng)物一樣的免疫功能[5-8]，且具有疫苗佐劑效果。補(bǔ)體C3分子是補(bǔ)體三條激活途徑中的樞紐，是機(jī)體防御機(jī)制中的關(guān)鍵分子。C3d是C3分子的裂解片段，研究發(fā)現(xiàn)C3d可以與CD21的結(jié)合位點(diǎn)存在，使其能夠發(fā)揮分子佐劑的作用從而在抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，不僅可以增強(qiáng)機(jī)體的初次免疫應(yīng)答，且對(duì)再次免疫應(yīng)答也具有良好的增強(qiáng)作用[9-12]。新型疫苗的研發(fā)離不開良好的疫苗佐劑的輔助，干擾素和補(bǔ)體分子單獨(dú)作為免疫佐劑時(shí)具有良好的佐劑效應(yīng)，而免疫細(xì)胞表面同時(shí)存在干擾素和補(bǔ)體分子的受體，本實(shí)驗(yàn)將干擾素與補(bǔ)體分子串聯(lián)表達(dá)，研究其在雞胚內(nèi)的抗病毒活性，并作為雞DNA疫苗的佐劑共同免疫，觀察其作為免疫佐劑的效應(yīng)，為疫苗佐劑的研發(fā)提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料E.coliBL21、表達(dá)載體pET29a(+)、雞新城疫病毒(NDV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；海蘭白殼種蛋和一日齡小雞購自洛陽公華禽業(yè)公司；限制酶、T4 DNA連接酶、Taq酶等均購自TaKaRa公司；其余試劑購自上海生工生物工程有限公司；pcDNA3.1-HA質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存。

1.2方法

1.2.1目的基因的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)Digby等[4]發(fā)表的chIFN-γ和C3d cDNA序列設(shè)計(jì)基因片段chIFN-γ和chIFN-γ-C3d，并分別在5′和3′端加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，并分別導(dǎo)入表達(dá)載體pET29a(+)中構(gòu)建成pET29a-chIFN-γ和pET29a-chIFN-γ-C3d載體。

1.2.2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 制備E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，將pET29a-chIFN-γ和pET29a-chIFN-γ-C3d質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入，卡那霉素抗性篩選陽性重組子，陽性菌株提取質(zhì)粒雙酶切鑒定并送生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。鑒定正確的菌株按1%比例接入300 ml 含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3.5～4 h使OD600值達(dá)到0.6～0.8，1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后收集菌體和上清一起進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析重組蛋白的表達(dá)方式，并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(cè)(一抗為兔抗6×His 標(biāo)簽多抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG單抗)，檢測(cè)正確后鎳柱純化重組蛋白，使用NanoDrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定蛋白含量。

1.2.3雞胚內(nèi)抗病毒活性測(cè)定 病毒滴度為210的NDV病毒液用PBS稀釋至27，chIFN-γ和chIFN-γ-C3d重組蛋白濃度分別設(shè)置梯度為1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml，組別分別標(biāo)記為γ-1、γ-5、γ-10、γ+C-1、γ+C-5和γ+C-10，另設(shè)NDV組和雞胚空白組。將病毒和蛋白1∶1 混合置于37℃孵育2 h后，按100 μl/胚的劑量接種到9日齡雞胚中，NDV組病毒與PBS 1∶1 混合，100 μl/胚注射，雞胚空白組每胚僅注射100 μl PBS，每組樣品設(shè)置3個(gè)平行。接種后雞胚繼續(xù)培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)死亡的，72 h后抽取尿囊液測(cè)病毒滴度，并觀察雞胚狀態(tài)。

1.2.4免疫佐劑效應(yīng)測(cè)定 將30日齡海蘭白殼蛋雞隨機(jī)分為6組：單獨(dú)的chIFN-γ組(γ組)、chIFN-γ-C3d組(γ+C組)、PcDNA3.1-HA組(HA組)、chIFN-γ+PcDNA3.1-HA組(γ+HA組)、chIFN-γ-C3d+PcDNA3.1-HA組(γ+C+HA組)、空白對(duì)照組，每組10只。chIFN-γ和chIFN-γ-C3d蛋白的用量為20 μg/只，PcDNA3.1-HA質(zhì)粒為50 μg/只。在雞30日齡時(shí)采血然后進(jìn)行首免、二免和三免分別間隔兩周進(jìn)行。首免后每周雞翅靜脈采血分離血清測(cè)抗體，一直測(cè)到首免后的第8周。首免后第3、4、6和8周采血分離淋巴細(xì)胞，MTT法測(cè)定雞淋巴細(xì)胞的增殖水平；并在首免后第3、6和9周采血并測(cè)量雞體重、胸腺、脾臟和法氏囊重量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1重組載體的雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果 篩選陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，在電泳圖上顯示大小約為5 000 bp和500 bp 的條帶，空載體酶切后僅一個(gè)5 000 bp左右的條帶，與預(yù)期片段大小相同(圖1)。測(cè)序結(jié)果用DNA Star的MegAlign與模板序列比對(duì)，結(jié)果100%吻合，證明表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。

2.2重組蛋白表達(dá)檢測(cè)和Western blot鑒定 陽性菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，離心分離上清和菌體，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蛋白主要以包涵體形式存在于菌體中(圖2A)。重組蛋白chIFN-γ與chIFN-γ-C3d大小分別在17 kD和21 kD，與理論值大小相符，說明蛋白可成功在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，兩者都在相應(yīng)位置處顯色，證明兩種蛋白均得以正確表達(dá)(圖2B)。將菌體破碎后用鎳柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化(圖2C)，純化后用透析袋對(duì)重組蛋白進(jìn)行濃縮，濃縮后的蛋白含量為chIFN-γ 0.67 mg/ml、chIFN-γ-C3d 1.273 mg/ml。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion of recombinant plasmidNote:M.DL5000 marker;1,2.pET29a-chIFN-γ-C3d double digestion;3.pET29a-chIFN-γ double digestion;4.pET29a empty vector for double digestion.

圖2 重組蛋白的表達(dá)純化及Western blot鑒定Fig.2 Expression and purification of recombinant protein and Western blot identificationNote:A.1,2.chIFN-γ-C3d supernatant sample;3.chIFN-γ-supernatant sample;M.pre-stained marker (9-180)kD;4,5.chIFN-γ-C3d bacterial cell precipitation sample;6.chIFN-γ bacterial cell precipitation sample;B.1.Low molecular weight marker (14.4-97.4)kD;2,3.chIFN-γ-C3d sample;4.chIFN-γ sample;5,6.chIFN-γ-C3d immunoblot sample;7.chIFN-γ Immunoblot sample；C.1.Purified γ protein;2.Purified γ+C protein；3.Low molecular weight marker (14.4-97.4)kD.

2.3重組蛋白chIFN-γ-C3d表達(dá)條件的優(yōu)化 對(duì)chIFN-γ-C3d誘導(dǎo)表達(dá)的菌種接種量、誘導(dǎo)前菌液濃度、不同誘導(dǎo)溫度、不同IPTG濃度以及不同誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)菌種最適接種量為1%；誘導(dǎo)前菌液最適濃度OD600=0.6；最適誘導(dǎo)溫度為37℃；IPTG濃度為1 mmol/L；誘導(dǎo)時(shí)間12 h。

2.4雞胚內(nèi)抗病毒活性測(cè)定結(jié)果 收集8組雞胚尿囊液測(cè)定病毒滴度，結(jié)果見圖4，可見不同濃度的chIFN-γ和chIFN-γ-C3d組的病毒滴度均低于NDV對(duì)照組，chIFN-γ組隨著蛋白濃度增加，病毒滴度下降，chIFN-γ-C3d蛋白低濃度時(shí)，病毒滴度降低，蛋白濃度高時(shí)病毒滴度反而上升，是串聯(lián)表達(dá)的影響、雞胚個(gè)體原因、還是實(shí)驗(yàn)誤差，后續(xù)將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。γ-10組和γ+c-1、γ+c-5組與NDV對(duì)照組相比均降低了3個(gè)滴度，差異性極顯著(P<0.01)，說明表達(dá)的chIFN-γ-C3d與chIFN-γ都具有抗病毒活性。

圖3 不同誘導(dǎo)條件表達(dá)的chIFN-γ-C3d的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electropherogram of different optimi-zation conditionsNote:1.Empty vector control;2.Uninduced control 3.Low protein marker (14.4-97.4)kD;A4-9.Inoculum 1%，2%，3%，4%，5%，6%；B4-10.different concentrations of OD600:0.2,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,and 1.0;C4-10.Induction at different tem-peratures:16℃,18℃,20℃,30℃,37℃,42℃;D4-10.Cons-entration of IPTG:0.5，0.75，1，1.5，2，2.5 and 3 mmol/L；E4-9.Induction time：1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h；F4-10.Induction time：12 h，14 h，16 h，18 h，20 h，22 h，24 h.

圖4 雞胚內(nèi)抗病毒活性測(cè)定Fig.4 Determination of antiviral activity in chicken embryos

圖5 免疫后雞血清HI抗體變化Fig.5 Chicken serum HI antibody curve after immunization

雞胚胚體觀察，NDV對(duì)照組24 h死亡一只，存活的雞胚胚體通紅，背部、腦后、翅下多處大面積出血；空白組體表未見出血點(diǎn)，體型特征正常；γ-1、γ+c-1組背部、腦后均可見出血點(diǎn)，但出血點(diǎn)與出血點(diǎn)面積少于NDV對(duì)照組；γ-5、γ+c-5組背部均未見出血點(diǎn)，僅腦后可見出血點(diǎn)；γ-10、γ+c-10組背部和腦后均未見出血點(diǎn)，但胚體比空白組小(圖略)。

2.5雞體內(nèi)HI抗體水平檢測(cè)結(jié)果 抗體檢測(cè)結(jié)果見圖5，HA組、γ+HA和γ+C+HA組抗體水平持續(xù)升高，且與HA組相比，γ+C+HA組抗體水平更高，差異極顯著(P<0.01)。第7周開始γ+C+HA組的抗體水平均高于γ+HA組，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。初步說明chIFN-γ和chIFN-γ-C3d都可以促進(jìn)雞體內(nèi)抗體的產(chǎn)生，且chIFN-γ-C3d的作用比chIFN-γ更顯著。

2.6雞淋巴細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果 分離雞外周血淋巴細(xì)胞，MTT法測(cè)定免疫細(xì)胞增殖活性，結(jié)果見圖6。

圖6 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Lymphocyte proliferation test results

圖7 免疫器官指數(shù)變化Fig.7 Changes of immune organs IndexNote: A.Spleen；B.Thymus；C.Bursa.

HA、γ+HA和γ+C+HA組淋巴細(xì)胞均顯示出較高的增殖活性，且γ+C+HA組增殖活性更高，與HA組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與γ+HA相比差異顯著(P<0.05)，說明chIFN-γ-C3d、chIFN-γ都具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用，并且chIFN-γ-C3d比chIFN-γ作用更強(qiáng)，差異顯著(P<0.05)。

2.7雞免疫器官增長指數(shù)測(cè)定結(jié)果 首免后第3、6和9周每組分別隨機(jī)選取3只雞，測(cè)量體重，脾臟、胸腺和法氏囊重量，計(jì)算免疫器官指數(shù)，結(jié)果見圖7。各組免疫器官指數(shù)在第6周最高，第9周已經(jīng)降低，這應(yīng)該與雞免疫器官的發(fā)育規(guī)律有關(guān)，但從免疫器官指數(shù)可以看出，雖然第6周時(shí)γ+C+HA組都不是最高，甚至低于其他組，但到第9周時(shí)，γ+C+HA組胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)都高于其他組，與γ+HA組相比差異極顯著(P<0.01)，說明chIFN-γ-C3d可以明顯延緩免疫器官衰退的時(shí)間，有助于維持機(jī)體的免疫功能。

3 討論

在國內(nèi)外干擾素和補(bǔ)體的研究中，人和哺乳動(dòng)物均有報(bào)道[13,14]，可作為佐劑在多種疾病的預(yù)防和治療中產(chǎn)生良好效果。Schlaepfer等[15]發(fā)現(xiàn)IFN-α基因?qū)IV的復(fù)制具有良好抑制作用。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)含有C3d的融合蛋白表達(dá)可提高免疫效果，Amanda 等[12]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體是抗微生物抗體的反應(yīng)中的關(guān)鍵佐劑。對(duì)禽類的相關(guān)研究，禹航等[16]將雞的IFN-γ在大腸桿菌中表達(dá)并分析了抗IBDV活性，表明IFN-γ對(duì)IBDV有明顯的抑制作用。劉棟[17]研究了重組雞C3d的免疫佐劑效果，證明不管是體外表達(dá)的C3d蛋白還是與DNA共同構(gòu)建成疫苗，都具有較好的免疫增強(qiáng)效果。

本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中串聯(lián)表達(dá)的chIFN-γ與補(bǔ)體C3d的主要片段，雞胚內(nèi)抗NDV測(cè)定表明，chIFN-γ-C3d和單獨(dú)表達(dá)的chIFN-γ都有抑制NDV病毒增殖的作用。與DNA疫苗共同免疫的測(cè)定表明chIFN-γ-C3d比單獨(dú)的chIFN-γ能輔助DNA疫苗產(chǎn)生更高水平的抗體，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，延緩免疫器官的衰退時(shí)間。結(jié)果表明原核表達(dá)的chIFN-γ-C3d對(duì)PcDNA3.1-HA具有免疫佐劑作用，可以作為一種新型疫苗佐劑應(yīng)用于DNA疫苗。