MAIT在帶狀皰疹中的免疫作用研究

黃 倩 王玉芝 黃 欣 李欣怡 李成文

(西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,瀘州 646000)

帶狀皰疹(herpes zoster，HZ)是一種機(jī)體免疫力降低時(shí)，體內(nèi)水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)重新被激活而導(dǎo)致的疾病，10%～30%的總?cè)巳涸谄湟簧袝?huì)發(fā)生HZ，而大于85歲的人群頻率會(huì)增加到50%，在老年人或體弱人群中常見(jiàn)，其特征是單側(cè)疼痛和皮疹[1,2]。HZ的常見(jiàn)并發(fā)癥是一種嚴(yán)重的持續(xù)性HZ后神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia,PHN)。HZ常用的藥物治療包括抗病毒、止痛、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、提高免疫力、局部外用藥、物理治療、皮質(zhì)類固醇激素等。抗病毒藥物主要是阿昔洛韋、更昔洛韋、膦甲酸鈉等。胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、B族維生素等可提高免疫力，糖皮質(zhì)激素在HZ的早期能緩解疼痛，但有嚴(yán)格的禁忌癥。音頻電療法、光療法可促進(jìn)皮損的恢復(fù)[3]。VZV特異性抗體不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，表明單獨(dú)的抗體不足以防止VZV再激活[4]。隨著年齡增長(zhǎng)觀察到VZV再激活主要?dú)w因于T細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低[5]。

黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(mucosal associated invari-ant T cells，MAIT)是非多態(tài)性(nonpolymorphic)MHCⅠb型主要組織相容性復(fù)合物相關(guān)蛋白(major histocomp-atibility complex classⅠb molecule，MHC classⅠ-related protein 1，MR1)限制的T淋巴細(xì)胞亞群[6]，分為三種亞型，即CD4+、CD8+(主要是CD8αα+)和CD4-CD8-細(xì)胞。MAIT與經(jīng)典的T細(xì)胞不同，具有多樣性有限的αβ T細(xì)胞受體(TCR)，由恒定的TCRα鏈(在人類，恒定Vα7.2與 Jα33、Jα12或Jα20配對(duì))與變化有限的TCRβ鏈的Vβ13(TRBV6)和Vβ2(TRBV20)組成[7]。MAIT在腸、肝和肺等部位富集，在血液循環(huán)中也很豐富，健康人的外周血中MAIT占T淋巴細(xì)胞的1%～10%[8]。以可溶性形式表達(dá)并用5-OP-RU 抗原重新折疊的人和小鼠四聚體MR1分子能夠檢測(cè)MAIT，由于這些試劑沒(méi)有被商業(yè)化，通常用Vα7.2+CD161+細(xì)胞作為MAIT的替代標(biāo)記，可以檢測(cè)大部分四聚體陽(yáng)性的MAIT[9]。因此MAIT被認(rèn)為是CD3+CD161+Vα7.2+T細(xì)胞，表現(xiàn)出與iNKT細(xì)胞相似的固有免疫功能。與iNKT細(xì)胞一樣，它們都表達(dá)恒定的TCRα鏈識(shí)別被MR1呈遞的抗原，通常是維生素B類代謝產(chǎn)物，此外，MAIT也可經(jīng)TCR非依賴方式參與免疫應(yīng)答[10]。MAIT活化后主要產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-17等細(xì)胞因子，也產(chǎn)生GZB、穿孔素等對(duì)受病毒感染的靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷清除[11]。研究報(bào)道，MAIT可發(fā)揮致病和治病作用[12]，但目前關(guān)于MAIT對(duì)HZ的免疫作用研究甚少，本研究通過(guò)檢測(cè)HZ患者外周血中MAIT的頻率和功能，分析MAIT與HZ的關(guān)系，以便為判斷HZ的病情和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象及分組 選擇2018年11月25日到2019年10月30日期間就診于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的25例HZ治療前患者作為治療前組，在入院第二天清晨被采集外周血。12例HZ患者口服鹽酸伐昔洛韋，輸注更昔洛韋及局部對(duì)癥治療5 d作為治療后組，再次采集外周血。選擇20例健康志愿者作為健康對(duì)照組。

1.1.2抗體和試劑 APC-CY7-抗CD3、PE-抗CD161、AF647-抗PD-1、PE-CY7-抗CD69、PE-CY7-抗IFN-γ、APC-抗GZB、BB515-抗TIM-3、AF647-抗IL-17A、Human BD Fc Block、Leukocyte Activation Cocktail、10×BD Perm/Wash buffer和固定破膜劑均購(gòu)自BD Biosciences；percp-cy5.5-抗TCR Vα7.2(美國(guó)BioLegend)；1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；Ficoll-plaque plus(GE healthcare)。

1.2方法

1.2.1外周血PBMC的分離 用EDTA抗凝管采集靜脈血5 ml，加入等體積PBS混勻后經(jīng)Ficoll plus密度梯度離心獲取PBMC，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MAIT 復(fù)蘇凍存的PBMC，加入3 ml含10%FBS的1640培養(yǎng)基混勻，接種到12孔板的3孔中，每孔細(xì)胞1×106個(gè)，在第一、二孔中均加入2 μl Leukocyte Activation Cocktail，混勻后于37℃、5%CO2中孵育6 h。分別收集3孔細(xì)胞，洗滌后每管加入1 μl FC block，室溫孵育10 min，每管加入APC-CY7-抗CD3、percp-cy5.5-抗TCR Vα7.2、PE-抗CD161，第二管加入BB515-抗TIM-3，第三管再加入AF647-抗PD-1、PE-CY7-抗CD69，4℃避光孵育30 min，洗滌后第一管和第二管均加入250 μl固定破膜劑，4℃避光孵育20 min，洗滌后第一管加入PE-CY7-抗IFN-γ、APC-抗GZB，第二管加入AF647-抗IL-17A。4℃避光孵育30 min，Wash buffer洗兩次棄上清，重懸后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征 研究共納入HZ患者25例，其中治療5 d后的患者12例，與患者年齡相匹配的同期健康志愿者20例?；颊叩呐R床和流行病學(xué)特征見(jiàn)表1。3組中年齡相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四種細(xì)胞的均值均在正常范圍內(nèi)。

CharacteristicGroupsControl group(n=20)HZ patients before treatment (n=25)HZ patients after treatment (n=12)Age49.85±16.647.24±14.4150.17±8.81Female10113Male10149Cell countsLeukocyte (109 L-1)6.51±1.205.39±1.28n/aNeutrophil (109 L-1)3.99±1.103.00±1.00n/aMonocyte (109 L-1)1.20±0.750.53±0.16n/aLymphocyte (109 L-1)1.14±0.991.71±0.53n/a

2.2MAIT在HZ患者外周血中頻率的變化 實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀確定了外周血中CD3+TCRVa7.2+CD161+細(xì)胞為MAIT。HZ治療前患者組MAIT頻率比健康對(duì)照組明顯降低(P<0.01，圖1B)?；颊咴诮邮芸共《局委? d后，外周血MAIT頻率比治療前增加(P<0.05，圖1B)，與健康對(duì)照組比較MAIT水平稍低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

圖1 健康對(duì)照組與HZ患者治療前和治療后MAIT頻率Fig.1 Frequency of MAIT of healthy controls,HZ patients of before treatment and HZ patients of after treatmentNote:*.P P

圖2 健康對(duì)照組與HZ患者治療前和治療后MAIT CD69、PD-1和TIM-3的頻率Fig.2 Frequency of CD69,PD-1 and TIM-3 in MAIT of healthy controls,HZ patients of before treatment and HZ patients of after treatmentNote:A.Representative flow cytometric plots of CD69,PD-1 and TIM-3 expression in MAIT in peripheral blood of three groups；B.Comparison of MAIT in peripheral blood of three groups.*.P PP

2.3MAIT活化、分泌細(xì)胞因子和功能耗竭的變化 CD69是MAIT的活化標(biāo)志，結(jié)果顯示與健康對(duì)照組比較，HZ治療前患者組外周血MAIT的CD69表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01，圖2B)，也比治療后患者組高(P<0.05，圖2B)；PD-1和TIM-3是免疫衰竭標(biāo)志物，HZ治療前患者組外周血中MAIT表達(dá)的PD-1比健康對(duì)照組顯著降低(P<0.05，圖2B)，比治療后患者組升高(P<0.05，圖2B)，治療后患者組PD-1比健康對(duì)照組降低(P<0.001，圖2B)；而TIM-3的表達(dá)比健康對(duì)照組高(P<0.01，圖2B)，也高于治療后患者組(P<0.05，圖2B)。分泌的GZB增高(P<0.001，圖3B)，也高于治療后患者組(P<0.01，圖3B)，但分泌的IFN-γ較健康對(duì)照組低(P<0.05，圖3B)，也低于治療后患者組(P<0.001，圖3B)。IL-17A在3組中表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3B)。

2.4不同病情程度的HZ患者外周血MAIT的頻率、表面分子及細(xì)胞因子比較 實(shí)驗(yàn)對(duì)患者的病情分為輕度和中重度[13]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，輕度組患者外周血MAIT頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中重度組顯著下降(P<0.01，圖4A)；中重度組MAIT表達(dá)的CD69高于健康對(duì)照組和HZ輕度組(P<0.001，圖4B)，分泌的GZB顯著高于健康對(duì)照組(P<0.001，圖4E)，也高于輕度組患者(P<0.05，圖4E)；健康對(duì)照組的IFN-γ比輕度和中重度組高(P<0.05，圖4F)，TIM-3則低(P<0.01，圖4D)。

圖4 健康對(duì)照組和HZ患者不同病情程度中MAIT、表面標(biāo)志物和細(xì)胞內(nèi)胞因子的頻率Fig.4 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls and patients with different degrees of disease in HZNote:*.P PP

3 討論

MAIT在不同的病毒感染中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有差異[14]，其在HZ中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究了MAIT在HZ中的作用，發(fā)現(xiàn)HZ治療前患者組外周血中MAIT的水平與健康對(duì)照組相比嚴(yán)重下降，活化水平隨病情程度的增加而上升，參與機(jī)體抗病毒免疫作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，MAIT產(chǎn)生的IFN-γ主要受NFAT1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，活化的NFAT1向核內(nèi)易位，與DNA相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合分泌IFN-γ[15]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中也發(fā)現(xiàn)MAIT中IFN-γ產(chǎn)生受損是由于Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的內(nèi)在缺陷所致。本研究中IFN-γ的減少可能是由于其中一種或兩種機(jī)制導(dǎo)致。TIM-3在病毒感染中引起T細(xì)胞死亡，Gal-9參與TIM-3誘導(dǎo)體外細(xì)胞死亡，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Gal-9劑量依賴性損傷IFN-γ的產(chǎn)生[16]，這可能也是本實(shí)驗(yàn)中MAIT分泌的IFN-γ減少的原因之一。

PD-1由多種促炎因子(LPS、GM-CSF、VEGF)和細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)誘生[17]。因此可以解釋本研究中治療前IFN-γ的分泌減少可能導(dǎo)致了PD-1的表達(dá)下降，逃脫了免疫抑制作用[18]，表現(xiàn)為活化增強(qiáng)，CD69表達(dá)升高。而治療后IFN-γ升高，TIM-3降低，可能是患者機(jī)體免疫功能逐漸恢復(fù)正常，不需要MAIT大量活化參與抗病毒。這些變化說(shuō)明MAIT參與了機(jī)體的抗病毒。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在成功清除和控制VZV感染中至關(guān)重要[19]。田瓊等[20]研究報(bào)道，HZ患者的臨床嚴(yán)重程度與淋巴細(xì)胞之間存在關(guān)聯(lián)。本研究顯示，病情越重，MAIT頻率越低，活化程度越高，表達(dá)TIM-3增多，但是分泌細(xì)胞因子IFN-γ降低，這與文獻(xiàn)高表達(dá)TIM-3的細(xì)胞分泌IFN-γ減少，殺傷功能減弱一致[21]。

VZV分離株表現(xiàn)出很少的序列變異性，與毒力無(wú)關(guān)，表明宿主免疫是疾病嚴(yán)重程度的主要決定因素，而不是病毒株之間的差異[22]。參照文獻(xiàn)[23]中對(duì)外周血T細(xì)胞分類的方法，GZB可劃分為耗竭型細(xì)胞因子，IFN-γ劃分為活化型細(xì)胞因子。研究顯示MAIT在HZ治療前患者組外周血中存在功能損傷，顯示了一種異常表型，即衰竭細(xì)胞因子升高，活化細(xì)胞因子降低。GZB促進(jìn)IL-6、IL-18等促炎性細(xì)胞因子的激活，導(dǎo)致炎癥和傷口愈合的延遲，其頻率與病變嚴(yán)重程度也呈正相關(guān)[24,25]。有研究表明，活化的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的GZB可能在不同的疾病環(huán)境中功能不同，可能與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)，也有研究表示，CD8+T細(xì)胞主要產(chǎn)生GZB ，但是不能控制或降低患者惡性瘧原蟲瘧疾的寄生蟲血癥[26,27]。研究顯示，PD-1不僅在Friend病毒(FV)感染的早期階段調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增，而且還調(diào)節(jié)它們分化，下調(diào)產(chǎn)生GZB的細(xì)胞毒性效應(yīng)因子。細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞(CTL)可有效控制急性病毒感染，但在發(fā)展為慢性感染時(shí)可能會(huì)功能耗竭。在人類免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒感染或FV感染中，病毒特異性CD8+T細(xì)胞就功能耗竭。CTL的功能障礙與抑制性檢查點(diǎn)受體的表達(dá)也有關(guān)，并且是這些受體與配體結(jié)合的結(jié)果[28]。因此，本實(shí)驗(yàn)中MAIT產(chǎn)生耗竭型GZB增多除了殺病毒感染細(xì)胞的能力下降而使病情加重外，可能也與PD-1的表達(dá)導(dǎo)致GZB的功能耗竭有關(guān)。根據(jù)上述討論，可以初步推測(cè)HZ患者的MAIT受VZV作用后，功能受損，分泌IFN-γ降低，從而使PD-1表達(dá)下降，有利于釋放GZB，導(dǎo)致MAIT耗竭，使得HZ病情加重或延緩。這種推測(cè)還需要后續(xù)系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療后MAIT頻率上升，CD69、PD-1下降，GZB分泌下降，但I(xiàn)FN-γ上升，可能是TIM-3的降低導(dǎo)致。因此，檢測(cè)HZ患者M(jìn)AIT頻率和功能有助于判斷病情和評(píng)估治療效果。