基于“脾為本虛”理論探討左歸復方對2型糖尿病小鼠腸道炎癥及黏膜屏障的影響①

向 琴 蔣宛瑾 喻 嶸 鄒曉玲 吳勇軍 劉 秀 劉子毓

(湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208)

據國際糖尿病聯盟(International Diabetes Federation,IDF)2017年報道，中國大陸20～79歲糖尿病患者數量為1.144億，位居全球第一。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)約占糖尿病發(fā)病人數的95%[1,2]。T2DM因其并發(fā)癥多、預后差，嚴重影響患者身心健康。胰島素抵抗和胰島素分泌不足是T2DM發(fā)病的重要病理生理機制，而全身慢性低度炎癥是引發(fā)胰島素抵抗的重要原因。越來越多的研究證明，腸道免疫-慢性炎癥在代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[3,4]。

中醫(yī)藥防治T2DM有著多靶點、整體調節(jié)的獨特優(yōu)勢。研究表明，中醫(yī)藥在改善糖脂代謝、胰島素抵抗和減輕全身慢性低度炎癥方面療效顯著[5-7]。近幾年來，中醫(yī)藥從調節(jié)腸道黏膜免疫防治T2DM也屢見不鮮[8,9]。左歸復方為明代著名醫(yī)家張景岳的左歸丸加減化裁而成，根據T2DM發(fā)病前期“以虛為本”的病機理論，主以健脾益氣，滋陰養(yǎng)腎。前期研究表明，左歸復方能降低T2DM小鼠血糖和炎癥因子[10,11]，對糖脂代謝具有調控作用，且多靶點[12,13]；能明顯改善“脾腎陰虛”的證候，但治療本虛的機制尚未明確。本研究以轉基因2型糖尿病MKR鼠為研究對象，通過觀察血糖、胰島素水平，檢測血清中內毒素(lipopolysaccharide,LPS)和炎癥相關因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量并檢測小鼠結腸組織緊密連接蛋白及炎癥信號通路關鍵因子的表達水平，探討2型糖尿病“脾為本虛”的理論機制及左歸復方的干預作用，為中醫(yī)理論提供實驗基礎，為左歸復方防治T2DM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 MKR小鼠由美國國立衛(wèi)生研究院授權使用引進，是采用組織特異性過度表達轉基因技術產生的骨骼肌胰島素樣生長因子1受體缺失的非肥胖型2型糖尿病小鼠，經自然交配后繁殖的子代用于實驗觀察。FVB小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2藥物和試劑 左歸復方由黃芪18 g、生地18 g、山藥9 g、葛根9 g、枸杞9 g、黃連6 g等9味藥組成，藥材購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,煎煮2次后合并煎液，過濾濃縮至含生藥量1 g/ml，置4℃冰箱備用；胰島素(iNS)、IL-6、IL-1β、TNF-α和LPS ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN生物技術公司；逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；TLR4/NF-κB通路蛋白及緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及給藥 選取8周齡的MKR小鼠，高脂喂養(yǎng)4周，隨機分為3組：模型組(Model)、左歸復方高劑量組(ZGFFG)、左歸復方低劑量組(ZGFFD)，每組8只。選取8只同齡FVB小鼠作為空白組(Control)。中藥低、高劑量組分別給予左歸復方煎液14 g/kg、56 g/kg灌胃，模型組和空白組給予等體積蒸餾水灌胃，每日給藥1次，連續(xù)治療4周。

1.2.2空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及胰島素(insulin,INS)的測定 給藥4周后禁食12 h，尾靜脈取血進行FBG檢測；眼球采血取血清，采用ELISA方法檢測INS。根據測定值計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，公式如下：HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3標本采集 給藥4周后禁食12 h，進行眼球采血。隨后立即取下腸道結腸組織，將結腸組織分為3份，分別放入4%的多聚甲醛、Trizol于-80℃保存。

1.2.4口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT) 禁食12 h后，依據小鼠不同體重，按照 2 g/kg 的葡萄糖總量，將50%的葡萄糖用蒸餾水稀釋成20%的葡萄糖后進行灌胃，分別在灌胃前及灌胃后30、60、90、120 min尾靜脈取血進行血糖檢測。

1.2.5結腸HE染色 結腸組織用4%的多聚甲醛室溫固定4 h，再進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，隨后制作2 μm的石蠟切片進行HE染色。

1.2.6ELISA 根據ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的血清含量。

1.2.7RT-qPCR檢測基因表達 結腸組織勻漿后，Trizol提取組織總RNA。引物由上海生工合成引物，見表1。反應條件95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達水平。

表1 檢測基因的引物序列

Tab.1 Primer sequences

Primer nameDirectionSequenceTLR-4F5′-AGACACTTTATTCAGAGCCGTTG-3′R5′-AAGGCGATACAATTCCACC-3′NF-κBF5′-TAGCCAGCGAATCCAGACCAACA-3′R5′-TGGGTCCCGCACTGTCACCT-3′Claudin-1F5′-AGCCCACATTTTGAAGCGTA-3′R5′-CCAAAGTGCAAAGACCGTCCA-3′OccludinF5′-ATCGTGGCTTTTGCTTTAATCATC-3′R5′-GGGCTGTTCATCATAAATGTGTT-3′ZO-1F5′-ACCGAAACCTGTGTATGCTC-3′R5′-ATCATTTCCACCAGCTAGTCG-3′β-actinF5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′R5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 取用蛋白裂解液提取結腸組織總蛋白，根據蛋白定量測定結果進行調平后，配置10%、15%的SDS-PAGE分離蛋白質，電轉移至NC膜。使用5%脫脂奶粉室溫封閉放置 60 min，4℃過夜。隨后加入一抗(TLR4,1∶3 000;NF-κB,1∶2 000;Claudin-1,1∶1 000;ZO-1,1∶1 000;Occludin,1∶1 000)，室溫孵育90 min，PBST洗3次后，加入HRP標記的二抗于室溫下孵育90 min，充分漂洗后加入ECL化學發(fā)光液顯色曝光，顯影沖洗。

2 結果

2.1左歸復方對MKR鼠血糖和胰島素敏感性的影響 如圖1所示，模型組與空白組比較，FBG和INS水平顯著升高(P<0.001)，提示存在糖耐量異常；而經過左歸復方干預后，左歸復方高劑量組和低劑量組均能顯著降低了FBG及INS水平(P<0.01，P<0.001)，且左歸復方高劑量組降低INS水平作用優(yōu)于低劑量組(P<0.001)。同時，計算胰島素抵抗指數HOMA-IR，結果顯示模型組HOMA-IR顯著高于空白組(P<0.001)；與模型組相比，左歸復方高劑量組和低劑量組胰島素抵抗指數HOMA-IR降低顯著(P<0.001)，但兩組之間無差異，提示左歸復方能有效改善糖代謝和胰島素抵抗。

2.2左歸復方對MKR鼠OGTT的影響 各組小鼠給予葡萄糖負荷后，均在30 min后血糖濃度達到峰值。從圖2中可以看出模型組各階段血糖值均高于空白組及左歸復方高劑量組和低劑量組，且糖耐量曲線下面積(AUS)顯著高于正常組(P<0.001)，而左歸復方高劑量組和低劑量組均能明顯降低AUS(P<0.01，P<0.001)。

圖1 左歸復方對血糖和胰島素敏感性的影響Fig.1 Effect of ZGFF on blood glucose and insulin sensitivity of MKR ratsNote: ###.P PP P

2.3左歸復方對MKR鼠結腸病理形態(tài)的影響 如圖3所示，空白組結腸上皮細胞連接緊密，黏膜完整，無充血、水腫、剝脫和炎性細胞浸潤現象；腸道上皮絨毛排列整齊且致密，腸腺形態(tài)正常。模型組可見結腸上皮細胞黏膜完整性受損，有充血、水腫和炎性細胞浸潤，絨毛稀疏變短，間隙變寬。經左歸復方治療后，結腸黏膜結構得到修復，上皮細胞連接緊密，未見充血和水腫，炎性細胞顯著減少，腸腺比模型組排列規(guī)則整齊。

2.4左歸復方對MKR鼠炎癥和血清LPS水平的影響 ELISA實驗結果如圖4所示，與對照組比較，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量和血清中LPS含量明顯增多(P<0.001)；與模型組比較，左歸復方高劑量組顯著降低了血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的含量(P<0.01，P<0.001)；左歸低劑量組能明顯降低IL-1β、IL-6和LPS的含量(P<0.05)，但對TNF-α含量降低不顯著。左歸復方高劑量組和低劑量組之間無顯著差異。

2.5左歸復方對TLR4/NF-κB通路mRNA表達的影響 為了進一步探究左歸復方對MKR鼠腸道慢性低度炎癥的作用機制，我們檢測了TLR4/NF-κB信號通路mRNA的表達情況。實驗結果表明，與空白對照組比較，模型組TLR4、NF-κB mRNA表達明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，左歸復方給藥組明顯下調TLR4、NF-κB mRNA的表達(P<0.05或P<0.001，圖5)，并且從圖中可以看出，左歸復方高劑量組要優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

圖2 左歸復方對MKR鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of ZGFF on OGTT of MKR ratsNote: ###.P PP

圖3 左歸復方對MKR鼠結腸病理形態(tài)的影響(HE染色，×100，×200)Fig.3 Effect of ZGFF on colonic tissues of MKR rats(HE staining,×100,×200)Note: HE staining was performed for phathology injury of rats.

圖4 左歸復方對MKR鼠炎癥和血清LPS水平的影響Fig.4 Effect of ZGFF on inflammation and LPS level of MKR ratsNote: ###.P PP PP=0.001 versus model group.

圖5 左歸復方對MKR鼠TLR4/NF-κB通路的影響Fig.5 Effects of ZGFF on TLR4/NF-κB signal pathway of MKR ratsNote: ###.P PP P

2.6左歸復方對TLR4/NF-κB蛋白表達的影響 同時我們檢測了TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達情況。如圖6所示，與空白組相比，模型組中TLR4、NF-κB蛋白含量顯著升高(P<0.001)；經過左歸復方干預后，左歸復方高劑量組和低劑量組TLR4、NF-κB蛋白含量與模型組相比均顯著下調(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。左歸復方高劑量組TLR4蛋白含量下調較低劑量組顯著(P<0.01)，但NF-κB蛋白含量兩組比較無顯著差異。

圖6 左歸復方對MKR鼠腸道TLR4/NF-κB蛋白表達的影響Fig.6 Effects of ZGFF on protein expression of TLR4/NF-κB of MKR rats in colon tissueNote: ###.P PP PP

圖7 左歸復方對MKR鼠腸道緊密連接蛋白mRNA表達的影響Fig.7 Effects of ZGFF on mRNA of Occludin,Claudin-1,ZO-1 of MKR rats in colon tissueNote: ###.P PP

2.7左歸復方對腸道緊密連接蛋白mRNA表達的影響 為了探究左歸復方對MKR鼠的組織慢性低度炎癥的調節(jié)機制，我們檢測了左歸復方對腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達的影響。如圖7所示，與空白組相比，模型組Occludin、Claudin-1、ZO-1 mRNA表達顯著下降(P<0.001)；經過左歸復方治療，與模型組相比，左歸復方高劑量組和低劑量組Occludin、ZO-1 mRNA的表達明顯升高(P<0.05,P<0.01)；左歸復方雖能一定程度上調Claudin-1 mRNA表達，但無顯著性差異。左歸復方高劑量組和低劑量組兩組相比也無顯著差異。

圖8 左歸復方對MKR鼠腸道緊密連接蛋白表達的影響Fig.8 Effects of ZGFF on protein expression of Occludin,Claudin-1,ZO-1 of MKR rats in colon tissueNote: ##.P PP P

2.8左歸復方對腸道緊密連接蛋白表達的影響 如圖8所示，模型組中Occludin、Claudin-1、ZO-1 蛋白含量顯著下降，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01,圖8)；與模型組相比，左歸復方高劑量組和低劑量組能明顯上調Occludin和ZO-1蛋白表達(P<0.05,P<0.001)，但左歸復方低劑量組的ZO-1 的蛋白表達無顯著差異；另外，左歸復方高劑量組的Claudin-1 蛋白水平與模型組相比，不僅沒有上升，反而一定程度上有所下調，且低劑量組與模型組相比無顯著性差異。

3 討論

全身低度慢性炎癥和代謝性內毒素血癥是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要原因。腸道革蘭陰性菌產生的LPS，可從破壞的腸道黏膜轉運到血液，導致代謝性內毒素血癥的發(fā)生[14]。特別是高脂肪飲食可導致腸道緊密連接蛋白(如Occludin和ZO-1)水平降低，腸道通透性增加[14]。這些變化使血漿中LPS水平升高，循環(huán)中的LPS在全身細胞中結合并激活TLR4，引起損害性細胞因子分泌增多，最終導致胰島素抵抗[15]。同時產生的炎癥因子又破壞腸道黏膜屏障，導致更多的促炎細胞到達腸道固有層，造成持續(xù)的腸道低度慢性炎癥，進一步加重機體胰島素抵抗[4,9]。

T2DM屬中醫(yī)“消渴”范疇。中醫(yī)認為，T2DM的根本病機為脾失健運、精不正化、肝腎陰虧。脾氣虧虛則運化無力，導致脈中精微物質(血糖)不能正常輸布利用，留于脈中，血糖升高。另一方面，衛(wèi)氣生于水谷，源于脾胃，可防外邪，循行于腸道，成為防御外邪的第一道屏障，如腸道黏膜屏障功能穩(wěn)健能防止有害代謝產物透過黏膜屏障而引發(fā)疾病的發(fā)生。但如果脾氣虧虛，則衛(wèi)氣生化無源、防邪無力、無力驅邪外出，將會導致外邪(有害代謝產物)入侵。左歸復方是治療T2DM的臨床驗方，以補脾益氣、滋陰降火為主，方中重用黃芪補益脾氣，又以生地滋補腎陰，輔以山藥健脾，充分體現了從脾論治的中醫(yī)治則理論，但其作用機制尚未明確。

本研究結果表明，左歸復方能明顯改善T2DM鼠胰島素抵抗，降低血液中LPS和炎癥相關因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度，以及下調腸道組織的TLR4/NF-κB基因和蛋白表達水平，提示左歸復方可能通過減輕腸道及全身慢性低度炎癥從而改善胰島素抵抗。另一方面，實驗研究表明，左歸復方還能修復腸道黏膜，上調腸道緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的基因和蛋白表達水平，維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)，為探討T2DM“脾為本虛”病機理論及左歸復方治療機制提供了一定的實驗基礎。

綜上所述，左歸復方可降低T2DM鼠血糖水平、改善胰島素抵抗，并能通過抑制炎癥因子、LPS從而減輕腸道持續(xù)慢性炎癥反應和內毒素血癥。由此可知，左歸復方以脾為本的治則與益氣健脾的治療機制可能與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路激活和上調腸道緊密連接蛋白表達密切相關。