新生兒B族鏈球菌早發(fā)型敗血癥與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的關(guān)系①

林彥青 邱曉媚 李盛勇 葉健斌 楊傳忠

(深圳市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，深圳 518028)

B族鏈球菌(group B Streptococcus，GBS)主要寄生于人類下消化道及泌尿生殖道，屬于條件致病菌，是圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一[1,2]。孕婦下生殖道致病微生物的逆行擴(kuò)散和順產(chǎn)過程中胎兒通過產(chǎn)道接觸致病微生物是GBS引起宮內(nèi)感染的主要途徑，而胎兒吸入或吞咽感染的羊水可導(dǎo)致呼吸道及全身感染。我國孕婦GBS帶菌率約為10.1%～32.4%，新生兒GBS所致早發(fā)型敗血癥的發(fā)病率約為1.6%～2.1%，高定植率和低發(fā)病率是圍產(chǎn)期GBS的流行病學(xué)特點(diǎn)之一。培養(yǎng)法是診斷新生兒早發(fā)型敗血癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測周期較長，不利于臨床醫(yī)師對病情的早期評估。既往已有研究證實(shí)，GBS中的夾膜多糖(CPS)、磷脂多糖(LPS)等可作用于母體及胎兒的炎性細(xì)胞并誘導(dǎo)其產(chǎn)生不同細(xì)胞因子，其中以巨噬細(xì)胞為主的固有免疫應(yīng)答在該過程中發(fā)揮重要作用[3,4]。因此本文通過Bio-plex懸浮芯片技術(shù)檢測多種血清因子，評估臍血中巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平在診斷新生兒早發(fā)型GBS感染中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1資料 本研究采取回顧性病例對照分析，選取2015年6月至2017年6月于深圳市婦幼保健院分娩新生兒80例。其中確診為母源性早發(fā)型GBS敗血癥的新生兒25例，母親陰道肛周分泌物培養(yǎng)法確診為GBS定植的新生兒 30例，正常對照組25例。試驗(yàn)經(jīng)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2016011)。GBS定植組入組標(biāo)準(zhǔn)：母親孕期確診GBS定植，新生兒生后隨訪7 d無感染癥狀者。GBS感染組入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2019年《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識》建議[5]，母親孕期確診GBS定植，新生兒于生后3 d內(nèi)發(fā)病，實(shí)驗(yàn)室檢查無菌體腔標(biāo)本(血、腦脊液)GBS培養(yǎng)陽性者。部分孕母確診GBS定植，但血培養(yǎng)陰性的新生兒出現(xiàn)發(fā)紺、呻吟、氣促等呼吸窘迫癥狀或體溫不穩(wěn)、花紋、低血壓等循環(huán)障礙，如胃液、皮膚拭子培養(yǎng)GBS陽性，且血液非特異性檢查(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、PCT等)異常者，排除其他病原菌感染也納入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和鑒定 孕期GBS確診方法[6]：用一次性無菌聚酯纖維拭子采集孕婦(孕周>34周)陰道和肛周分泌物進(jìn)行鑒定培養(yǎng)(培養(yǎng)方法：B族鏈球菌選擇性培養(yǎng)平板)，并排除其他陰道常見病原菌(衣原體、支原體)混合感染。

新生兒GBS早發(fā)型敗血癥確診方法：臨床標(biāo)本(血液、腦脊液、剛娩出新生兒的胃液及皮膚拭子)經(jīng)培養(yǎng)法確診GBS陽性且母親孕期已確診GBS定植的新生兒。

1.2.2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到不同炎癥刺激時(shí)，以下細(xì)胞因子和趨化因子可發(fā)生變化(見表1,其中巨噬細(xì)胞游走抑制分子MIF為抑制性趨化因子)。需要特別強(qiáng)調(diào)的是雖然巨噬細(xì)胞是這些細(xì)胞因子的主要來源，但他們也可以由活化的淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生[7-9]。

表1 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子

Tab.1 Polarization-related cytokines and chemokines in macrophages

Cell typesCytokinesChemokinesM1IFN-α,IL-12,IL-23MIF(control)、CXCL8-10TNF-α,IL-1βCCL3,CCL17M2IL-4,IL-10,IL-13CCL2,CCL17,CCL22

1.2.3細(xì)胞因子和趨化因子的檢測方法 待檢測臍動(dòng)脈血2 ml，離心留取上清液放置-80℃?zhèn)溆?。采用Bio-plex懸液芯片多重檢測技術(shù)，檢測目標(biāo)細(xì)胞因子和趨化因子水平。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中待檢因子的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果

2.1臨床資料 根據(jù)2010美國CDC《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》建議，我院對34～37周孕婦常規(guī)篩查生殖道和直腸分泌物。對篩查陽性的病例隨訪其分娩的新生兒，根據(jù)臨床檢測方法將不同診斷結(jié)局分為GBS定植組(30例)和GBS感染組(25例)，并收集同時(shí)期孕母明確無GBS定植的臨床病例25例作為正常對照組。2例(8%)產(chǎn)前發(fā)熱(體溫>37.5℃)，5例(20%)胎膜早破，1例(4%)胎盤病理為絨毛膜羊膜炎。入選的新生兒臨床基本特征見表2。

2.2Bio-plex細(xì)胞因子和趨化因子檢測范圍 通過Bio-plex繪制待檢細(xì)胞因子和趨化因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測上限與檢測下限見表3。

2.3GBS介導(dǎo)臍血M1、M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的變化

2.3.1GBS介導(dǎo)臍血中M1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的變化 GBS感染組和GBS定植組的臍血血清中IFN-γ、CXCL9和CXCL10的表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，且GBS感染組的IFN-γ和CXCL9高于GBS定植組(P<0.05)，同時(shí)GBS定植組的MIF表達(dá)水平顯著低于正常對照組。該結(jié)果提示GBS定植但無感染狀態(tài)下新生兒體內(nèi)的巨噬細(xì)胞具有向促炎癥的M1巨噬細(xì)胞分化并有分泌相關(guān)細(xì)胞因子的趨勢。見圖1。

表2 80例入選病例基本臨床特征

Tab.2 Basic clinical features of 80 cases

GroupsnGenderMaleFemaleGestationalage(week)Complications(n)1)The control group25121338.03±3.422GBS engraftment group30131738.32±3.142GBS infection group25121337.84±2.993

Note：1)The mother during pregnancy complications including:gestational diabetes,gestational hypertension,intrahepatic cholestasis during pregnancy.

表3 待檢測細(xì)胞/趨化因子的檢測下限和檢測上限

Tab.3 Lower and upper detection limits of target cytokines and chemokines

Cytokines/chemokineUpper limit(pg/ml)Lower limits(pg/ml)IFN-γ6.159 721.27CXCL91.652 2748.40CXCL101.6519 561.15MIF16.76418 963.35CCL30.261 118.17IL-41.024 177.51IL-100.184 898.93CCL20.345 465.54CCL170.193 454.44

圖1 三組研究對象M1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平比較Fig.1 Comparision of polarization-related cytokines and chemokines levels of M1 macrophages in three groupsNote:*.P

2.3.2GBS介導(dǎo)臍血中M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的變化 GBS感染組中IL-4、IL-10和CCL17的水平均高于另外兩組(P<0.05)，但三組的CCL2水平并沒有明顯變化。該結(jié)果提示GBS定植且感染狀態(tài)下新生兒體內(nèi)的巨噬細(xì)胞具有向抗炎癥的M2巨噬細(xì)胞分化并分泌相關(guān)細(xì)胞因子的趨勢。見圖2。

圖2 三組研究對象M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平比較Fig.2 Comparision of polarization-related cytokines and chemokines levels of M2 macrophages in three groupsNote:*.P

3 討論

GBS沿生殖道逆行至宮內(nèi)時(shí)，上皮細(xì)胞是抵御病原菌感染的第一道防線。其中巨噬細(xì)胞是黏膜皮膚屏障的主要固有免疫應(yīng)答細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)、吞噬、消滅外來入侵病原體，刺激細(xì)胞因子的釋放，在功能上極具可塑性，隨微環(huán)境中不同細(xì)胞因子和趨化因子的作用，M0巨噬細(xì)胞可極化為M1巨噬細(xì)胞或M2巨噬細(xì)胞[10,11]，目前多數(shù)學(xué)者的觀點(diǎn)認(rèn)為這兩種極化作用相互拮抗[12]。當(dāng)病原體入侵機(jī)體時(shí)，M0接觸干擾素gamma(IFN-γ)后可極化為M1，產(chǎn)生炎性因子。IFN-γ可激活JAK-STAT信號通路中STAT1，活化巨噬細(xì)胞對微生物的殺傷能力和抗原提呈能力，并促使促炎細(xì)胞因子的分泌和殺死入侵的病原體，其獨(dú)特的Toll樣受體(TLR)和環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cGAS)可通過招募趨化因子(CCL3、CXCL8-10等)和釋放細(xì)胞因子(IL-6)來激活其他免疫細(xì)胞[13-15]。此外，M1巨噬細(xì)胞分泌高水平活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，產(chǎn)生iNOS，促進(jìn)精氨酸分解為一氧化氮和瓜氨酸，介導(dǎo)病原體的死亡[16]。本次研究結(jié)果表明，GBS感染組和GBS定植組的臍血血清中M1極化相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ水平高于正常對照組，GBS定植組中M1相關(guān)的趨化因子CXCL9和CXCL10水平高于正常對照組，提示新生兒在GBS定植狀態(tài)，M0主要向M1極化。

M2是具有抗炎活性的巨噬細(xì)胞亞群，可大量分泌IL-10，拮抗M1的促炎作用，在炎癥反應(yīng)的主要功能是限制組織損傷，抑制炎癥反應(yīng)。有研究證明在感染性疾病中，病原體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化從而逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)。GBS表面的三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬，刺激IL-10分泌，在早期發(fā)揮抗炎作用。但隨著體內(nèi)IL-10增高，可反饋性抑制中性白細(xì)胞的抗炎作用，超過了在單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中IL-10的直接抗炎作用，促進(jìn)GBS的增殖。在IL-10出現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)的新生兒或新生鼠的GBS感染模型中，敗血癥的發(fā)生率增高[17,18]。雖然趨化因子CCL17由M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，但有研究發(fā)現(xiàn)M2的極化與CCL17的顯著上調(diào)有關(guān)。這與本文中三組CLL17變化趨勢一致。此外，GBS感染組中M2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)水平也高于另外兩組。因此推斷，宮內(nèi)GBS定植狀態(tài)下，休眠狀態(tài)的巨噬細(xì)胞M0即可極化為M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。當(dāng)發(fā)生宮內(nèi)感染時(shí)，M0極化為M2，抑制過度炎癥反應(yīng)。但與此同時(shí)，不利于機(jī)體對病原菌的清除作用。除了在初始炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用外，感染誘導(dǎo)極化后的巨噬細(xì)胞可高表達(dá)共刺激分子CD80/CD86，進(jìn)一步作為高效的抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)抗炎特異性T細(xì)胞的極化方向[19]。值得一提的是以往觀點(diǎn)認(rèn)為新生兒期細(xì)胞免疫應(yīng)答不健全，因此易合并細(xì)菌感染。但近期研究發(fā)現(xiàn)，懷孕中期胎兒的T細(xì)胞功能已發(fā)育較成熟且數(shù)目正常，因未經(jīng)外界抗原誘導(dǎo)分化，90%為表達(dá)CD45+的初始 CD4+T細(xì)胞[20]。機(jī)體接觸病原菌后，初始CD4+T細(xì)胞通過識別抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)MHC-Ⅱ呈遞的抗原，從而分化成不同類型的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞亞群。與成人相比，新生兒體內(nèi)抑制Th1極化/促炎反應(yīng)的模式識別受體(PRR)激動(dòng)劑較成人明顯增高，足月新生兒體內(nèi)PRR激動(dòng)劑較早產(chǎn)兒高，而較成人明顯增高?？杀苊庠诓≡w刺激下，Th1極化產(chǎn)生不利于維持機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)的促炎反應(yīng)。因此，巨噬細(xì)胞的極化方向后續(xù)可能催化機(jī)體感染GBS后觸發(fā)不同類型的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，巨噬細(xì)胞參與新生兒GBS早發(fā)型敗血癥的免疫應(yīng)答過程，巨噬細(xì)胞的極化過程與新生兒GBS早發(fā)型敗血癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。