mGluR6對大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響＊

王玉玨，辛寧寧

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè)（延安716000）；2.咸陽師范學(xué)院校醫(yī)院（咸陽712000）

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是危害人類健康重大疾病之一，神經(jīng)損傷后的治療和康復(fù)是醫(yī)學(xué)界的重要問題［1－2］。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，改變了以往認(rèn)為成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不能再生的觀念，這促使干細(xì)胞成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療新策略而備受關(guān)注。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，在特定的條件下可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。許多因素例如神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、化學(xué)引誘物等參與調(diào)控NSCs的分化與增殖。谷氨酸是NSCs中最關(guān)鍵的性神經(jīng)遞質(zhì)，它通過與相應(yīng)的受體分子作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能［3］。根據(jù)藥理學(xué)和電生理學(xué)的特征，谷氨酸受體分為兩種：即代謝型受體（Metabotropic glutamate receptors，mGluRs）和離子型受體（Ionotropic glitamate receptors，iGluRs）。iGluRs按其特異靶向激動劑的不同，又分為α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－異惡唑丙酸（AMPA）、N－甲基－D－門冬氨酸（NMDA）及紅藻氨酸（KA）三類受體；mGluRs屬于G－蛋白偶聯(lián)受體家族，按其氨基酸序列、激動劑選擇性和信號傳導(dǎo)機制的差異分為三組，分別為組I（mGluR1，mGluR5）、組II（mGluR2－3）和組III（mGluR4，mGluR6－8［4］。作為G蛋白耦聯(lián)受體家族，mGluRs的生物學(xué)功能主要通過激活胞內(nèi)第二信使通路從而引起生物學(xué)效應(yīng)［5］。

自1993年研究者將mGluR6從大鼠視網(wǎng)膜的cDNA文庫中分離出來［6］，Masu等人發(fā)現(xiàn) mGluR6主要存在于視網(wǎng)膜細(xì)胞中，并在視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的突觸傳遞中發(fā)揮重要作用［7］。Foreman等人通過Western blot方法在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達，這也是研究人員首次在除視網(wǎng)膜外的其它細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達，他們的研究結(jié)果表明mGluR6通過抑制Ca2＋內(nèi)流，抑制一氧化氮（NO）的產(chǎn)生［8］。隨后，人們在前列腺癌細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達［9］。值得一提的是，Vardi等人通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在mGluR6啟動子區(qū)域構(gòu)建GFP報告基因，在角膜內(nèi)皮、睪丸、腎髓質(zhì)、腎小球、以及B淋巴細(xì)胞等非神經(jīng)組織細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達［10］。該研究結(jié)果拓寬了人們對mGluR6調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的認(rèn)識，說明mGluR6并不局限于視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)揮作用，但其相應(yīng)的調(diào)控機制至今未見報道。最近Zheng等在人緣表皮角化細(xì)胞系HaCaT中研究表明，敲除mGluR6導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組，進一步研究發(fā)現(xiàn)mGluR6可能通過CaM KII／ERKMLC信號通路調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用［11］，截至目前，mGluR6是否參與NSCs生長及其調(diào)控機制還鮮見相關(guān)報道。在這個研究中，我們旨在探討mGluR6對大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

材料和方法

1 實驗動物 Sprague－Dawley（SD）大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。本研究中使用的實驗動物的飼養(yǎng)嚴(yán)格遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令第55號發(fā)布的《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細(xì)則》和國家科學(xué)技術(shù)委員會第2號令發(fā)布的《實驗動物管理條例》。孕鼠受孕后15d，對胚胎鼠進行分離，然后對大鼠胚胎NPCs進行培養(yǎng)。研究得到了延安大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意。

2 實驗試劑 DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基，N2、B27添加劑，bFGF購自Gibco公司（美國）；EGF、肝素、MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）購自Sigma公司（美國）；AnnexinⅤ－FITC凋亡試劑盒購自美BD Bioscience公司（美國）；RIPA裂解液購于碧云天公司；兔抗mGluR6、鼠抗β－Actin均購自Santa Cruz Biotechnology公司（美國）；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自Pierce公司（美國）。

3 大鼠胚胎皮質(zhì)NPCs的分離和培養(yǎng) 胚胎分離自孕15d大鼠，動物處理符合倫理要求和原則。從這些胚胎中分離腦組織并將其置于DMEM／F12中，去除所有腦膜后，分離大腦皮層，用DMEM／F12沖洗兩次；將分離的大腦皮層切成小塊，37℃胰酶消化5 min，用吸管吹打分散使組織分散為單細(xì)胞。用200目篩網(wǎng)過濾后，將細(xì)胞懸液移到離心管中，800轉(zhuǎn)離心5min后，重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng／ml EGF，10ng／ml bFGF，1× B27 supplement，1× N2supplement，100U／ml鏈霉素，100U／ml青霉素，0.4U／ml肝素）中，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105／ml后，以4ml／瓶接種于T50培養(yǎng)瓶中，37℃孵育，5～7d后傳代。（本研究所用的NSCs均為傳1代的細(xì)胞）。

4 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實驗所需mGluR6 siRNA序列由上海吉瑪公司合成，序列信息如下：鼠mGluR6siRNA：sense 5’－CCCCAGUGAUGUUCA AUGATT－3’antisense 5’－UCAUUGAACAUCACUGGGGTT－3’隱形對照 siRNA NC－siRNA：sense 5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’antisense 5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’過 表 達 載體pCMV2－GV146－GFP－mGluR6由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，6孔板中NSCs細(xì)胞數(shù)量為（0.8～2.4）×105，生長1d后加入過表達質(zhì)粒DNA 4μg或者干DNA片段4μl以及TurboFectTM 6 μl進行轉(zhuǎn)染，并通過qRT－PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

5 RNA提取及qRT－PCR 采用Omega試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測量RNA濃度。根據(jù)生物信息學(xué)設(shè)計合成mGluR6和β－actin的qRT－PCR引物，序列如 下： mGluR6－F5 ’－GGACGCCAAGTAGCAAGGTT－3’ mGluR6－R5 ’－TCCGATGGTCTCTGTGGATCT －3’β－Actin－F5’－GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA－3’β－Actin－R5’－GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG－3’，使用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光實時定量PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及qRTPCR，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進行反應(yīng)，條件為：95℃，1min預(yù)變性，95℃變性10s，60℃退火，延伸40s，重復(fù)40個循環(huán)，采用2－ΔΔCt的方法計算 mGluR6的表達量。

6 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6影響鼠NSCs的細(xì)胞周期 按照2×104個／孔將傳1代的NSCs種入6孔板中，每孔單細(xì)胞懸液為2ml，培養(yǎng)48h后加藥物干預(yù)。實驗分組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)。24h后，處理各組單細(xì)胞懸液，PI染色，流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6對鼠NSCs細(xì)胞周期的影響。

7 MTT實驗檢測mGluR7對人胚胎NSCs細(xì)胞活力的影響 按照2×104個／孔將傳1代的NSCs種入96孔板中，每孔單細(xì)胞懸液為200μl，常規(guī)培養(yǎng)48h后，給予藥物干預(yù)。實驗分為三組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組。每組設(shè)3個復(fù)孔，在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h后上機檢測鼠胚胎NSCs細(xì)胞增殖能力。

8 神經(jīng)球直徑測量 神經(jīng)球直徑測量實驗步驟如下：將傳1代的NSCs分散成單個細(xì)胞，按照20000個／孔種入96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h后給予藥物干預(yù)。實驗分組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組。分別于轉(zhuǎn)染后24h，48h和72h后，通過Image－Pro Express（IPP）圖像分析軟件并取圖片，進而研究mGluR6對各組神經(jīng)球直徑的影響。

9 通過流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6對鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同上，最后加入400μl的1×binding buffer，反復(fù)混勻重懸細(xì)胞，再加5μl Annexin V－FITC，于4°C避光染色15min。最后加入10μl PI染液，避光4°C染色5min，采用流式細(xì)胞儀檢測，分析mGluR6對鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用單因素方差分析（One－Way ANOVA）進行差異分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過表達或沉默mGluR6后其表達變化 為了研究mGluR6對大鼠胚胎NSCs生長對影響，我們構(gòu)建了mGluR6的干擾RNA表達質(zhì)粒（mGluR6siRNA）、過表達質(zhì)粒（mGluR6）及對照質(zhì)粒。我們對大鼠胚胎NSCs細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了干擾RNA（mGluR6 siRNA）、過表達（mGluR6）和對照質(zhì)粒。通過qRTPCR和Western Blot檢測 mGluR6的過表達及沉默效率，結(jié)果表明大鼠胚胎NSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后，在mRNA和蛋白水平mGluR6的表達量均顯著升高（圖1A，B）；轉(zhuǎn)染 mGluR6siRNA后，在 mRNA和蛋白水平mGluR6的表達量均顯著降低（圖1A，B），證實了mGluR6的過表達載體和mGluR6siRNA是有效的，并將用于后續(xù)的細(xì)胞功能實驗。

圖1 在人NSCs中過表達或沉默mGluR6后其表達變化

2 mGluR6對大鼠NSCs增殖的影響 我們通過MTT實驗檢測過表達或沉默mGluR6對大鼠NSCs增殖的影響。結(jié)果表明，大鼠胚胎NSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達mGluR6質(zhì)粒48h后，顯著促進了細(xì)胞活力（圖2A）；轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA質(zhì)粒48h后，顯著抑制了細(xì)胞活力（圖2B）。為了進一步檢測mGluR6對大鼠神經(jīng)球增殖的影響，我們測量了神經(jīng)球直徑，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒組的神經(jīng)球直徑明顯比對照組大（圖3A），而轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA質(zhì)粒組的神經(jīng)球明顯小于對照組（圖3B）。這表明mGluR6促進了大鼠NSCs增殖。

3 mGluR6對大鼠NSCs細(xì)胞周期的影響 為了研究mGluR6對大鼠NSCs細(xì)胞周期的影響，我們將mGluR6過表達和干擾siRNA分別轉(zhuǎn)染至大鼠NSCs細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀進行檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染mGluR6過表達質(zhì)粒后，G1／G0期和細(xì)胞比率顯著下降，S期細(xì)胞比率顯著上升，促進了細(xì)胞周期G1到S期轉(zhuǎn)換（圖4、5）；而轉(zhuǎn)染 mGluR6siRNA 后，G1／G0期和細(xì)胞比率顯著增加，S期細(xì)胞比率顯著下降，抑制了細(xì)胞周期G1到S期轉(zhuǎn)換（圖6、7）。

4 mGluR6對大鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響 為了研究mGluR6對大鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響，我們將mGluR6過表達質(zhì)粒和干擾siRNA分別轉(zhuǎn)染至大鼠NSCs細(xì)胞中。通過流式細(xì)胞儀進行檢測，和對照組相比，轉(zhuǎn)染mGluR6過表達質(zhì)粒的細(xì)胞早凋和晚凋比率均顯著下降（圖8、9）；而轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA的大鼠NSCs早凋和晚凋比率均顯著增加，特別是晚凋比率顯著增強（圖10、11）。

圖2 mGluR6對大鼠NSCs增殖的影響（MTT比色）

圖3 mGluR6對大鼠神經(jīng)球增殖的影響（神經(jīng)球直徑）

圖4 流式細(xì)胞儀檢測大鼠NSCs的Control組和mGluR6組周期圖譜

圖5 轉(zhuǎn)染mGluR6表達載體對大鼠NSCs周期影響（＊P＜0.01）

討 論

在發(fā)育和成熟哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）的研究為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的損傷、治療和修復(fù)帶來了希望。目前，NSCs已經(jīng)被廣泛用來治療Huntington病、缺血性中風(fēng)、脫髓鞘病及腦等CNS疾病，NSCs的治療手段已被廣大同行認(rèn)可，特別在改善神經(jīng)損傷、腦缺血以及神經(jīng)變性紊亂相關(guān)疾病后的神經(jīng)功能［12－16］。研究NSCs并應(yīng)用在CNS替代治療中，基因調(diào)控及蛋白質(zhì)功能改變對NPCs的增殖起著非常重要的作用。所以，探究NPCs增殖過程中的分子網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機制在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)及神經(jīng)退行性疾病的治療等方面具有重要價值。

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)谷氨酸可能通過mGluRs對腦損傷后的神經(jīng)發(fā)生有一定的調(diào)控作用［17－18］。本 小 組 前 期 研 究 中 發(fā) 現(xiàn)，mGluR3［19］、mGluR5［20］和 mGluR7［21］均與 NSCs的生物學(xué)功能有著密切的關(guān)系。mGluR6是代謝性谷氨酸受體第III組的重要成員。自1993年被Nakajima等人報道m(xù)GluR6在大鼠視網(wǎng)膜中生物學(xué)功能以來［6］，許多研究表明mGluR6在視桿和視錐細(xì)胞的突觸傳遞過程中至關(guān)重要。最近，Devi等人發(fā)現(xiàn)mGluR6在人類黑色素細(xì)胞中表達，且能夠促進黑色素的含量［22］。但是，mGluR6是否參與NSCs生長及其調(diào)控機制還不清楚，值得進一步深入研究。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測大鼠NSCs的NC－siRNA組和mGluR6siRNA組周期圖譜

圖7 轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA對大鼠NSCs周期的影響（＊P＜0.01，n＝3）

圖8 流式細(xì)胞儀檢測大鼠NSCs的Control組和mGluR6組凋亡圖譜

圖9 轉(zhuǎn)染mGluR6表達載體對大鼠NSCs凋亡的影響（＊P＜0.01，n＝3）

Zhao等研究發(fā)現(xiàn)了mGluR5促進了人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖及其機制［20］。為研究mGluR6對神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究選擇以大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）為研究材料，通過構(gòu)建mGluR6過表達和siRNA處理大鼠胚胎NSCs，分析其對細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，mGluR6過表達載體能增加體外培養(yǎng)的大鼠NSCs的細(xì)胞活力和神經(jīng)球的大小。相反，mGluR6siRNA降低了NSCs的細(xì)胞活力和神經(jīng)球的大小。這些研究結(jié)果表明，mGluR6可促進體外培養(yǎng)的大鼠胚胎NSCs的增殖。

圖10 流式細(xì)胞儀檢測大鼠NSCs的NC－siRNA組和mGluR6siRNA組凋亡圖譜

圖11 轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA對大鼠NSCs凋亡的影響（＊P＜0.01，n＝3）

細(xì)胞周期中G1向S期的過渡是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要節(jié)點，當(dāng)G1／S節(jié)點通過后，細(xì)胞周期依次進行，然后逐漸回到G1期，這個階段不容易受到其他調(diào)節(jié)因素［23］的影響。M期表明細(xì)胞處于增殖和分裂階段，S期表明細(xì)胞開始新一輪的DNA復(fù)制和分裂。本研究發(fā)現(xiàn)，在 mGluR6siRNA處理NSCs后，G1／G0期細(xì)胞比率升高，S期細(xì)胞比率下降，mGluR6siRNA將人NSCs細(xì)胞阻滯在G1／G0期，細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂顯著減少。但與之對應(yīng)的是，過表達mGluR6后，與對照組相比G1／G0期細(xì)胞比率顯著下降，S期細(xì)胞比率顯著上升，mGluR6過表達促進了細(xì)胞G1到S期轉(zhuǎn)化。

綜上所述，mGluR6同其它mGluRs在促神經(jīng)發(fā)生方面主要可能通過以下功能來實現(xiàn)：①直接的促增殖作用；②促NSCs／神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化；③促存活、抗凋亡神經(jīng)保護作用。