超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜快速測定天王補心片中五味子醇甲和藁本內酯含量*

史 寧，郭宏舉，耿 帥，常李榮

戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學中心藥學部(北京 100101)

天王補心片是由丹參，當歸，石菖蒲，黨參，茯苓，五味子，麥冬，天冬，地黃，玄參，遠志(制)，酸棗仁(炒)，柏子仁，桔梗，甘草，朱砂共16 味中藥組成的復方制劑[1]，具有滋陰、養(yǎng)血、補心安神的作用。五味子和當歸在本方中作為佐藥，主要有益氣斂陰養(yǎng)血的功效[2]。五味子醇甲及藁本內酯分別是五味子和當歸中的主要活性成分[3-4]。在藥典(2015版)藥品標準項目中，測定了對天王補心丸中五味子醇甲的含量[5]。另有研究報道，運用高效液相色譜法對天王補心丸其他主要成分，如梓醇、丹參素、丹酚酸B及6 種木脂素的定量進行測定[6-9]，但該方法靈敏度及分離效果有一定的欠缺。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS方法對天王補心片中兩種主要成分五味子醇甲、藁本內酯同時測定，為進一步優(yōu)化天王補心片質量控制標準提供一定的參考。

資料與方法

1 儀器與試藥 Waters超高效液相-四級桿飛行時間質譜系統(tǒng)；賽多利斯BS124S 型電子天平。五味子醇甲，批號Z16M6B1，純度98%以上，上海源葉生物科技有限公司產品；藁本內酯，批號J1420063，純度98%以上，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；天王補心片，批號分別為150505、150807、160501、160602、160710、170305，重慶巨琪諾美制藥有限公司產；質譜級乙腈，批號151902，美國Fisher公司產品。

2 實驗方法

2.1 條件：濃度為0.1%甲酸-水溶液I相，濃度為 0.1%甲酸-乙腈為II相；以0.4 ml/min設置流速；5%II～95%II洗脫0～15 min；95%II洗脫15.1～25 min；5%II洗脫25.1～30 min。

2.2 質譜條件：錐孔電壓和毛細管電壓分別設置為40 V和3.0kV，同時設定為120 ℃的離子源溫度，脫溶劑溫度和脫溶劑氣流速分別設置為500 ℃和800 L·h-1，以亮氨酸腦啡肽進行質量校對，正離子模式，正離子556.2771，選擇離子分別為五味子醇甲415.22及藁本內酯191.11。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備：于10 ml量瓶中精密稱取適量的五味子醇甲及藁本內酯對照品，甲醇定容后，均勻搖晃使其溶解，即得對照品儲備液。于10 ml量瓶中精密量取適量五味子醇甲及藁本內酯對照品儲備液，甲醇定容并溶解，所得溶液質量濃度為五味子醇甲0.101 mg/ml，藁本內酯0.200 mg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備：分析天平精密稱取天王補心片約500 mg并研細，置于10 ml量瓶內，70%甲醇溶解至8 ml，超聲(120W，60Hz)提取60 min，放至室溫后70%甲醇定容，均勻溶解后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取上清。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備：按處方工藝制備不含五味子醇甲及藁本內酯的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法操作。

結 果

1 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各2 μl進樣，正離子掃描模式，記錄質譜圖，結果如圖1所示。陰性樣品在五味子醇甲及藁本內酯出峰處無干擾，證明樣品中無其他成分干擾測定。五味子醇甲及藁本內酯分別為7.76 min及8.90 min。

A:天王補心片 B:陰性樣品

2 線性關系考察及檢測限、定量限測定 適量量取上述混合對照品溶液，采用倍數(shù)稀釋法，用甲醇稀釋，配置稀釋倍數(shù)分別為20、40、80、200、400和800標準溶液，檢測條件不變進樣，記錄各峰面積。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果如表2所示。以信噪比S/N=3 和S/N=10 時，定量限和檢測限以各對照品溶液的質量濃度表示，結果如表1所示。

表1 五味子醇甲、藁本內酯樣品回歸方程、標準曲線、定量限和檢測限

3 精密度試驗 混合對照品溶液精密吸取后連續(xù)進樣6次，計算各成分峰面積的RSD，藁本內酯的RSD為5.55%，五味子醇甲的RSD為4.31%，證明儀器具有良好的精密度。

4 重復性試驗 按精密度實驗所述方法制備6份樣品(批號201504042)的供試品溶液分析，所測溶液中各成分平均含量及其RSD分別為五味子醇甲0.38 mg/g及藁本內酯0.36 mg/g，RSD分別為5.09%及3.55%，結果表明該方法重復性良好。

5 加樣回收率考察 精密稱定500 mg天王補心片并研細，置于10 ml量瓶內，加入8 ml 70%甲醇，超聲(120W，60Hz)提取60 min，放至室溫。將五味子醇甲和藁本內酯對照品儲備液精密加入，甲醇定容后0.22 μm微孔濾膜過濾，取上清液進樣測定，計算五味子醇甲及藁本內酯的平均回收率分別為95.33%和97.25%，RSD 分別為3.15%及4.47%。結果表明，兩種主要成分回收率在95%以上，符合測定要求。

6 樣品測定 5個批號的天王補心片各3份制備供試液，分析和記錄色譜峰面積，運用各成分相應的回歸方程計算丹五味子醇甲及藁本內酯的含量，結果見表2。

表2 天王補心片中五味子醇甲及藁本內酯的含量(mg/g)

討 論

天王補心片作為國家基本藥物，其標準已收錄到國家中成藥標準。天王補心片主要包含16味中藥，為丹參、當歸、石菖蒲、黨參、茯苓、五味子、麥冬、天冬、地黃、玄參、制遠志、酸棗仁(炒)、柏子仁、桔梗、甘草、朱砂。其中五味子能夠清除自由基、提高人體抵抗力，而含量較高的木脂素類成分五味子醇甲是其有效活性成分。當歸作為整個方劑中的佐藥，具有補血潤燥等功效，地位非常重要[10]。因此我們在測定五味子醇甲的同時，又選擇了當歸中的主要活性成分藁本內酯作為檢測對象。

UPLC-Q-TOF-MS 是高分辨串聯(lián)質譜，具有高分辨率、高靈敏度、高效率的特點，能夠對復雜體系的化合物進行快速測定[11-14]。此外相比于高效液相色譜，超高效液相色譜由于色譜柱的固定相粒徑更小，分離效果更好，因此能夠將天王補心片中這兩種成分分開而互不干擾。

該技術早已成熟并在研究中廣泛得到證實，鄂秀輝[15]等通過采用UPLC-Q-TOF-MS法分析加參片提取物中14種入血原型成分，主要包括丹參、黃芪、加香皮和三七等。

本實驗基于以往經(jīng)驗，首次建立了天王補心片中五味子醇甲和藁本內酯含量檢測的超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜快速測定方法，對天王補心片6個批次中五味子醇甲及藁本內酯同時進行定量分析。研究顯示，天王補心片中五味子醇甲及藁本內酯的含量均在0.3～0.4 mg/g之間，說明該藥中藁本內酯與五味子醇甲含量相近，同時二者的平均回收率分別為95.33%和97.25%，均高于95%，并且RSD值較小，可充分證明此方法精密度高、重復性小、簡便快速。藁本內酯與五味子醇甲分別為當歸和五味子的主要成分，具有較好的生物活性，該研究為天王補心片的深入研究奠定了較好的試驗基礎，此方法也為天王補心片生產中五味子醇甲與藁本內酯含量作為質量控制提供參考依據(jù)。