糖耐量異?；颊吲c糖耐量正常人群腸道菌群差異性研究

王智峰 徐心悅 姜玫

【摘要】 目的 探討糖耐量異常（IGT）患者和糖耐量正常人群腸道菌群的差異性。方法 選取20例糖耐量異?；颊咦鳛檠芯拷M， 另選20例接受健康體檢的健康人群作為常規(guī)組。收集所有研究對(duì)象的新鮮糞便樣品， 提取其中的細(xì)菌總DNA， 采用細(xì)菌通用擴(kuò)增引物分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增， 對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物展開測(cè)序分析， 測(cè)序完成后， 使用ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢驗(yàn)?zāi)c道中常見的細(xì)菌種類。比較兩組腸道菌群種類及數(shù)量。結(jié)果 通過(guò)檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)， 本研究所有樣品中共檢查出三類細(xì)菌， 分別為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門， 而擬桿菌門細(xì)菌是人體腸道中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。研究組擬桿菌門中普雷沃氏菌屬與擬桿菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（2.3±1.4）、（5.1±1.5）種低于常規(guī)組的（5.5±2.0）、（8.1±2.5）種， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組厚壁菌門中毛螺菌屬與乳酸菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（2.2±1.3）、（1.3±0.8）種低于常規(guī)組的（6.2±2.1）、（7.0±2.8）種， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組變形菌門中大腸埃希菌與志賀菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（4.3±1.3）、（4.1±1.2）種， 對(duì)照組變形菌門中大腸埃希菌與志賀菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（5.1±1.4）、（4.3±1.3）種， 兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 糖耐量異?；颊吣c道菌群中優(yōu)勢(shì)菌群的含量明顯低于糖耐量正常人群腸道中優(yōu)勢(shì)菌群的含量， 需要針對(duì)性地展開治療。

【關(guān)鍵詞】 糖耐量異常;腸道菌群;差異性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.07.022

隨著科技進(jìn)步， 人們的生活質(zhì)量越來(lái)越高， 糖耐量異?；颊叩哪c道菌群情況逐漸成為醫(yī)療界的重點(diǎn)研究對(duì)象[1]。腸道菌群主要包括人體腸道中的小生物群或基因組。大量實(shí)驗(yàn)表明， 腸道菌群不僅會(huì)影響到人體的整體健康， 還是導(dǎo)致肥胖、糖尿病等慢性疾病的主要危險(xiǎn)因素[2]。葡萄糖耐量是指人體對(duì)攝入葡萄糖的耐受能力， 糖耐量異常（IGT）的判斷標(biāo)準(zhǔn)為人在用餐結(jié)束的2 h內(nèi)， 血糖值大于正常值， 但尚未達(dá)到糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn)， 即稱作糖耐量異常[3]。本課題重點(diǎn)研究了糖耐量異常患者的腸道菌群特點(diǎn)， 以及和健康人群之間的區(qū)別， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2018年3～8月本院內(nèi)分泌科收治的20例糖耐量異?；颊咦鳛檠芯拷M， 另選取于本院接受健康體檢的20例健康人群作為常規(guī)組。研究組中， 男12例， 女8例;年齡31～45歲， 平均年齡（38.5±4.2）歲。

常規(guī)組中， 男9例， 女11例;年齡34～43歲， 平均年齡（38.2±4.1）歲。兩組患者一般資料比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。本次研究已經(jīng)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證， 并且所有研究對(duì)象均詳細(xì)了解整體過(guò)程， 同意進(jìn)行研究并簽訂知情同意書。

1. 1. 1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①與世界衛(wèi)生組織（WHO）和國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）糖尿病專家委員會(huì)（1999年）指出的糖耐量異常判斷標(biāo)準(zhǔn)完全吻合。②空腹時(shí)血糖值<7.0 mmol/L。③接受葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2 h后， 血糖值<11.1 mmol/L[4]。

1. 1. 2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①患者年齡>25歲且<75歲。②處

于妊娠或者哺乳期的女性。③6個(gè)月前伴有嚴(yán)重高血壓、心肌梗死或者腦血管意外病史的患者。④患者在研究前3個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗生素， 且在半個(gè)月內(nèi)未服用益生元或益生菌等藥物。⑤研究前3個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)腹瀉、便秘、痢疾等疾病[5]。

1. 2 方法

1. 2. 1 樣本收集 在無(wú)菌環(huán)境下， 分別收集兩組研究對(duì)象的新鮮糞便， 在糞便中心位置收集10～15 g， 置入無(wú)菌冷存管后冷藏， 樣品收集的整體過(guò)程均和醫(yī)院的倫理要求符合[4]。

1. 2. 2 DNA采集 實(shí)驗(yàn)樣品中微生物總DNA的提取工作， 使用購(gòu)自德國(guó)的QIAamp DNA Stool Mini Kit儀器進(jìn)行， 樣品量為100 mg， 詳細(xì)的操作方法參考說(shuō)明書進(jìn)行。將收集的DNA使用購(gòu)自美國(guó)的NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定， 然后置于-80℃的環(huán)境下冷藏備用[6]。

1. 2. 3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 參考獲得的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增工作和產(chǎn)物測(cè)序， 16S rRNA PCR引物的主要構(gòu)成包括：測(cè)序接頭引物、Index以及V3區(qū)引物。Index是一種主要構(gòu)成為6bp核苷酸的序列， 主要用途為標(biāo)記PCR產(chǎn)物的來(lái)源。PCR的擴(kuò)增體系共包括25 μl， 擴(kuò)增條件為：①在98℃的環(huán)境下預(yù)變性30 s;②在98℃環(huán)境下變性10 s， 在50℃的環(huán)境下退火30 s， 在72℃的環(huán)境下延伸30s， 持續(xù)循環(huán)20次;③在72℃的環(huán)境下延伸7 min， 并于4℃的環(huán)境下儲(chǔ)存。反應(yīng)完成后， 使用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增片段的大小， 使用QIAquick Gel Extraction Kit儀器處理目的條帶膠。使用美國(guó)的Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)獲得16S rRNA-V3區(qū)的PCR產(chǎn)物展開測(cè)序[7]。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析和熒光定量PCR 測(cè)序完成后， 對(duì)PCR產(chǎn)物的高質(zhì)量序列展開提取， 然后使用ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢驗(yàn)?zāi)c道中常見的細(xì)菌種類[8]。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)， 本研究所有樣品中共檢查出三類細(xì)菌， 分別為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門， 而擬桿菌門細(xì)菌是人體腸道中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。研究組擬桿菌門中普雷沃氏菌屬與擬桿菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（2.3±1.4）、（5.1±1.5）種低于常規(guī)組的（5.5±2.0）、（8.1±2.5）種，

差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組厚壁菌門中毛螺菌屬與乳酸菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（2.2±1.3）、（1.3±0.8）種低于常規(guī)組的（6.2±2.1）、（7.0±2.8）種， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組變形菌門中大腸埃希菌與志賀菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（4.3±1.3）、（4.1±1.2）種， 對(duì)照組變形菌門中大腸埃希菌與志賀菌屬細(xì)菌種類數(shù)量分別為（5.1±1.4）、（4.3±1.3）種， 兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

葡萄糖耐量是指機(jī)體對(duì)體內(nèi)葡萄糖的耐受能力。若在飯后2 h血糖值超過(guò)正常指標(biāo)， 即7.8 mmol/L， 但沒(méi)有超過(guò)糖尿病判斷標(biāo)準(zhǔn)（11.1 mmol/L）;或者患者在空腹時(shí)血糖值雖然上升， 處于6.2～7.0 mmol/L之間， 但未達(dá)到糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn)， 即稱作糖耐量異常[9]?，F(xiàn)階段， 醫(yī)療界已經(jīng)將糖耐量異常作為糖尿病初期發(fā)病的黃金指標(biāo)。相關(guān)資料[10]表明， 每年約有7%的糖耐量異?；颊咿D(zhuǎn)化成2型糖尿病， 并且糖耐量異?；颊甙l(fā)生心肌梗死、心絞痛等心血管疾病的幾率也會(huì)隨之上升。隨著科技的不斷進(jìn)步， 關(guān)于腸道菌群的研究漸漸增加。腸道菌群屬于腸道中的小生物群或者其他基因組織。大量實(shí)驗(yàn)指出， 腸道菌群不僅能夠保持人體的整體健康， 還和肥胖、2型糖尿病等慢性代謝性疾病的發(fā)生、惡化具有緊密聯(lián)系。在人類的胃腸道中， 已知的細(xì)菌數(shù)量超過(guò)1000種， 數(shù)量約為1014個(gè)。菌群的生物學(xué)分類從大到小分別為種、屬、科、目、綱、門， 現(xiàn)階段的研究大多集中在“門”與“屬”這兩個(gè)范圍， 在此基礎(chǔ)上研究不同菌群和機(jī)體代謝之間的聯(lián)系[11]。

目前， 國(guó)內(nèi)糖耐量異常的患者基數(shù)日益增加， 但是對(duì)于該類患者的干預(yù)治療措施相對(duì)較少， 臨床效果相對(duì)較差[12]。通過(guò)本研究能夠明確不同糖耐量異?；颊叩哪c道菌群特征， 分析糖耐量異?；颊吲c糖耐量正常人群之間的差別， 通過(guò)調(diào)控腸道菌群來(lái)避免糖耐量異常患者發(fā)展成為糖尿病， 從而降低糖尿病的發(fā)病率， 以及因糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致的社會(huì)問(wèn)題及經(jīng)濟(jì)壓力。

機(jī)體腸道中的微生物菌群與機(jī)體自身的代謝功能具有緊密聯(lián)系， 其含量與種類的改變會(huì)直接引起各類慢性代謝類疾病。大量實(shí)驗(yàn)指出， 體內(nèi)微生物菌群與機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)之間均具有緊密聯(lián)系[13]。

綜上所述， 糖耐量異?；颊叩哪c道菌群和健康人群相比存在明顯的差異， 因此需要針對(duì)性的實(shí)施治療。

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[收稿日期：2019-07-17]