胸腔積液LPS、IL-35、RORα表達(dá)在結(jié)核性胸膜炎、惡性胸膜炎鑒別診斷中的價(jià)值

雷朝君 蔣晨春 高嫵媚

胸膜炎是由于炎癥、腫瘤等各種因素刺激胸膜所產(chǎn)生的胸膜炎癥，其主要病因?yàn)榻Y(jié)核和惡性腫瘤[1]。對(duì)于結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎早期做出鑒別，對(duì)于臨床采取針對(duì)性干預(yù)措施改善預(yù)后具有重要意義，目前對(duì)于結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別，多依賴于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)或胸膜組織活檢，但胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌較少，常規(guī)檢測(cè)方法難以檢測(cè)出來(lái)；胸膜穿刺活檢會(huì)對(duì)患者帶來(lái)一定創(chuàng)傷，且標(biāo)本采集困難，可重復(fù)性差[2]。近年來(lái)生物標(biāo)志物逐漸應(yīng)用于胸膜炎的診斷，雖然目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)單一、有效的鑒別良惡性胸膜炎的生物學(xué)標(biāo)志物，但多種生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)有望大幅度提高良惡性胸膜炎的鑒別診斷準(zhǔn)確性[3]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是構(gòu)成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，在結(jié)核局部免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]；維甲酸相關(guān)孤兒受體α(retinoic acid related orphan receptor α, RORα ) 也是一種與結(jié)核病的發(fā)生密切相關(guān)的小分子調(diào)控蛋白，可對(duì)機(jī)體的多種生理過(guò)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]；白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-35是一種對(duì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖具有抑制作用的細(xì)胞因子，與感染性疾病、自身免疫性疾病的病情發(fā)展有一定關(guān)系[6]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究表明，胸腔積液中LPS、IL-35、RORα與結(jié)核性胸膜炎病情密切相關(guān)[7-8]。但三種生物標(biāo)志物能否用于結(jié)核性胸膜炎與惡性胸膜炎鑒別診斷尚不得而知。本研究對(duì)比分析結(jié)核性胸膜炎、惡性胸膜炎患者胸腔積液中LPS、IL-35、RORα表達(dá)情況，探討三種生物標(biāo)志物單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)，在結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷中的價(jià)值。

資料與方法

一、 一般資料

前瞻性納入本院2017年1月至2020年12月收治的結(jié)核性胸膜炎患者126例(良性組)，男性72例，女性54例，年齡最小19歲，最大77歲，平均(57.32±9.79)歲。并選擇同期與本院接受診治的惡性胸膜炎患者88例(惡性組)，其中男51例，女37例，年齡最小20歲，最大78歲，平均(57.86±9.73)歲，致病原因：肺癌胸腔轉(zhuǎn)移47例，胃癌胸腔轉(zhuǎn)移16例，胸膜間皮瘤11例，子宮內(nèi)膜癌胸腔轉(zhuǎn)移8例，卵巢癌胸腔轉(zhuǎn)移6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②胸腔積液為滲出液；③良性組符合《肺結(jié)核診斷和治療指南(2001年訂)》[9]中結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢查或病理檢查確診；④惡性組經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)檢查確診；⑤初次接受診治；⑥自愿參加本研究，并簽署協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未獲得明確診斷；②入組前曾接受相關(guān)治療；③合并肺炎、肺膿腫等其他感染性疾?。虎芎喜⒛到y(tǒng)疾??；⑤合并心肝腎嚴(yán)重器質(zhì)性疾病或內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病、精神類疾病等。⑥妊娠或哺乳期女性。

二、方法

兩組患者均于無(wú)菌條件下進(jìn)行胸腔穿刺術(shù)，術(shù)前經(jīng)超聲定位引導(dǎo)，常規(guī)消毒、鋪單，局麻下將穿刺針穿入胸腔，抽取胸腔積液約10mL，試管肝素抗凝，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，離心半徑r=12cm，室溫下靜置60min，分離上清液置于-80℃冰箱內(nèi)待測(cè)，免疫熒光法測(cè)定胸水腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase， ADA)含量，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定胸水LPS、IL-35、RORα、鱗癌抗原(squamouse cell carcinoma antigen、SCC)神經(jīng)源特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)含量，具體操作：在微孔酶標(biāo)板上設(shè)10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度順序依次加樣，稀釋后各孔加入待測(cè)樣品50μl，37℃下孵育30min，緩沖液洗滌5次，之后每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，再次按上述過(guò)程進(jìn)行孵育、洗滌，先后加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，混勻后避光顯色15min，每孔各加入終止液50μl，終止反應(yīng)后以450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度。LPS、RORα試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供， IL-35、CA125、SCC、NSE試劑盒由深圳晶美生物制品有限公司提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。并測(cè)定兩組胸腔積液中白蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)含量及白細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。

三、觀察指標(biāo)

比較良性組、惡性組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、胸腔積液的實(shí)驗(yàn)室檢查等臨床資料，將上述組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的資料帶入logistic回歸模型，采用多因素logistic回歸分析良性胸膜炎發(fā)生的影響因素。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評(píng)價(jià)胸水LPS、IL-35、RORα單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷價(jià)值。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，良性胸膜炎發(fā)生的影響因素應(yīng)用多因素logistic回歸分析，ROC曲線評(píng)價(jià)胸水LPS、IL-35、RORα對(duì)結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別診斷價(jià)值，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用與各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用ROC曲線面積的比較應(yīng)用Z檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組臨床資料比較

良性組胸水ADA、LDH、LPS、IL-35、RORα含量及白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于惡性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、胸水SCC、NSE含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

二、結(jié)核性胸膜炎發(fā)生影響因素分析

以發(fā)生結(jié)核性胸膜炎為因變量，以表1中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量，將正常值作為分界點(diǎn)分別賦值1和0(見表2)。多因素logistic回歸分析顯示胸水中LPS、IL-35、RORα是結(jié)核性胸膜炎的影響因素(見表3)。

表1 良性組和惡性組臨床資料比較

表2 表1中自變量的賦值表

表3 良性胸膜炎多因素logistic回歸分析結(jié)果

三、胸水LPS、IL-35、RORα在結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷中的價(jià)值

繪制受試者工作特征曲線，顯示胸水LPS、IL-35、RORα鑒別結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的ROC曲線下面積分別為0.683、0.602、0.647，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用ROC曲線下面積為0.903，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用鑒別結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎價(jià)值均高于各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1、表4、5)。

表4 胸水LPS、IL-35、RORα單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用鑒別結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的價(jià)值

圖1 胸水LPS、IL-35、RORα單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用鑒別結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的ROC曲線

表5 胸水LPS、IL-35、RORα單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用鑒別結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的價(jià)值比較結(jié)果

討 論

胸膜積液是胸部多種疾病的并發(fā)癥，肺部、胃腸道、女性生殖系統(tǒng)、乳腺等多部位的惡性腫瘤及結(jié)核性胸膜炎、肺炎等多種良性炎癥性疾病均可導(dǎo)致胸腔積液的發(fā)生[10]。結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液(包括轉(zhuǎn)移瘤、間皮瘤)是滲出性胸腔積液的最為常見原因。且兩種原因所致胸膜炎性反應(yīng)的臨床特點(diǎn)、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相似，鑒別診斷存在一定困難[11-13]。結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核分枝桿菌入侵胸膜腔所致的胸膜炎性反應(yīng)性疾病，是丙類法定傳染??；而惡性胸膜炎是由惡性腫瘤細(xì)胞刺激胸膜所產(chǎn)生的胸膜炎癥，是惡性腫瘤進(jìn)展至晚期的常見并發(fā)癥，惡性胸膜炎的發(fā)生往往提示機(jī)體存在全身轉(zhuǎn)移，患者生存期縮短[14]，結(jié)核性和惡性胸膜炎對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響不同，其治療方法也存在很大差異，因此對(duì)于結(jié)核性和惡性胸膜炎早期鑒別診斷對(duì)于臨床治療方案的選擇至關(guān)重要。目前臨床醫(yī)師對(duì)于結(jié)核性和惡性胸膜炎的鑒別主要結(jié)核分枝桿菌檢出或胸膜組織穿刺活檢，但胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌檢出率較低，且細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)；胸膜穿刺存在一定創(chuàng)傷，可重復(fù)性差，且多數(shù)檢測(cè)結(jié)果特異性較差[15]。尋求敏感、特異性好的生物學(xué)指標(biāo)或幾種生物學(xué)治療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于結(jié)核性和惡性胸膜炎的鑒別診斷具有重要意義。

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，其主要成分為脂質(zhì)和多糖，也是革蘭氏陰性細(xì)菌主要的致病物質(zhì)。LPS可與細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4結(jié)合，并通過(guò)特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路激活絲裂原活化蛋白酶信號(hào)途徑和轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)途徑，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的大量合成和釋放；并可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞釋放IL-8，對(duì)中性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化作用；LPS還可刺激動(dòng)脈外膜的成纖維細(xì)胞，使之產(chǎn)生IL-8、調(diào)節(jié)活化蛋白等多種趨化因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)良性組胸水LPS含量顯著高于惡性組，LPS可能參與了胸膜結(jié)核的局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，促進(jìn)了結(jié)核性胸腔積液的形成。IL-35是IL-12家族重要組成部分，也是一種具有炎癥抑制作用的細(xì)胞因子；由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的Ebi3和IL-12的P35亞基組成，可誘導(dǎo)傳統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞分化為抑制性的CD4+Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[17]。IL-35可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化免疫病原體的清除，同時(shí)還對(duì)Th17細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，從而抑制機(jī)體過(guò)度的免疫應(yīng)答。Kong等[18]的研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者機(jī)體內(nèi)IL-35呈現(xiàn)高表達(dá)，提示IL-35與肺結(jié)核病灶的活動(dòng)性相關(guān)，血液中IL-35含量有望成為活動(dòng)性肺結(jié)核免疫狀態(tài)、預(yù)后評(píng)估的有效的生物指標(biāo)。目前關(guān)于IL-35與胸腔積液的相關(guān)性研究不多，本研究發(fā)現(xiàn)良性組胸水IL-35含量顯著高于惡性組，提示IL-35可能在結(jié)核性胸膜炎發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。RORα是維甲酸相關(guān)孤兒受體的重要組成部分，在腎臟、肝臟、腦組織、肺臟等多種臟器中廣泛表達(dá)，可調(diào)控腦組織、淋巴組織的發(fā)育等生理過(guò)程。研究表明，RORα是參與Th17細(xì)胞分化的重要物質(zhì)之一，RORα激動(dòng)劑逐漸成為抗炎治療的重要靶點(diǎn)，研究表明，敲除RORα基因的小鼠對(duì)于卵白蛋白誘導(dǎo)的肺部炎癥易感性明顯降低[19]，另有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)核性胸腔積液中RORαmRNA含量顯著高于非結(jié)核性胸腔積液[20]。本研究結(jié)果顯示結(jié)核性胸膜炎患者胸水中RORα含量高于惡性組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明RORα可能在結(jié)核性胸腔積液的形成中發(fā)揮了積極的作用。

結(jié)核病是一種遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，胸膜的炎癥反應(yīng)使血管通透性增加，進(jìn)而大量淋巴細(xì)胞和蛋白質(zhì)進(jìn)入胸腔積液，本研究發(fā)現(xiàn)胸水中LPS、IL-35、RORα含量升高是結(jié)核性胸膜炎發(fā)生的影響因素，上述3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于結(jié)核性、惡性胸膜炎的鑒別具有較高的臨床價(jià)值。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，胸腔積液同時(shí)滿足LPS含量>274.34μg/L、IL-35含量>188.48ng/L和RORα含量>147.63μg/L時(shí)，診斷為結(jié)核性胸膜炎的可能性較大，籍此可與惡性胸膜炎鑒別。

綜上所述，結(jié)核性胸膜炎胸腔積液中，LPS、IL-35、RORα呈高表達(dá)，胸腔積液LPS、IL-35、RORα在結(jié)核性和惡性胸膜炎的鑒別診斷中具有較高的臨床價(jià)值，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。