維生素D對特發(fā)性肺纖維化Ⅱ型肺泡上皮作用的研究進展

趙寧 曹大偉 張新日

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不可逆轉的肺纖維化疾病，男性較女性多發(fā)，常見于50歲以上人群，平均預期生存時間3-5年，目前認為Ⅱ型肺泡上皮細胞(type 2 alveolar epithelial cells，AT2)的反復損傷是IPF的起始事件。AT2是維持肺泡結構和功能的關鍵細胞，反復損傷致其功能異常及衰老凋亡，引發(fā)上皮-成纖維細胞的異?；?，誘導成纖維細胞灶形成和大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積[1-2]。目前對IPF尚無令人滿意的治療方法，因此研究相關治療藥物迫在眉睫。文獻報道維生素D可以抑制AT2衰老凋亡、抑制纖維化相關通路和AT2上皮間質(zhì)轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)延緩肺纖維化進展，有望成為IPF輔助治療藥物,本文就維生素D對IPF中AT2作用的研究進展作一綜述。

AT2衰老凋亡驅動IPF

肺泡由AT2和Ⅰ型肺泡上皮細胞(type 1 alveolar epithelial cells，AT1)組成。AT1是鱗狀上皮細胞，覆蓋在大部分肺泡表面，形成肺泡上皮屏障，其薄片形狀便于附近的毛細血管網(wǎng)與外界進行氣血交換。除了分泌表面活性物質(zhì)維持肺泡形態(tài)，AT2還增生分化為AT1，維持肺泡上皮屏障的完整性。既往認為IPF為慢性炎癥疾病，但抗炎治療并未抑制疾病進展，許多證據(jù)表明AT2在IPF的發(fā)病機制中起著核心作用。

內(nèi)在因素(遺傳、年老)和外在因素(吸煙、病毒感染)均可引起AT2損傷并影響祖細胞功能，導致低效的再上皮化，造成基底膜和間質(zhì)暴露，并通過旁分泌的方式引發(fā)上皮-成纖維細胞異?；樱瑢е鲁衫w維細胞過度激活和分化，造成大量ECM沉積和肺結構破壞[1-2]。在IPF患者肺組織中，異常AT2常位于成纖維細胞灶附近，成纖維細胞灶是分泌大量ECM的成纖維細胞和肌成纖維細胞簇，為IPF的典型病理特征之一[1]。

AT1受損后，AT2會自我復制并分化為AT1，但反復損傷引起的持續(xù)的AT2增生分化，會導致端粒變短，加速細胞衰老。當AT2無法分化再生成正常肺泡上皮并產(chǎn)生足夠的表面活性蛋白時，肺內(nèi)機械張力隨即升高，引起AT2繼發(fā)性損傷，加劇了上皮細胞耗竭并激活AT2胞內(nèi)TGF-β 信號，形成惡性循環(huán)，加速肺纖維化進展[3]。因此反復的AT2損傷最終引起細胞衰老凋亡，實驗表明肺纖維化小鼠肺部AT2數(shù)目減少，這種重要祖細胞的耗竭，不僅造成肺泡修復再生能力大幅下降，也預示著纖維化的發(fā)生[4]。細胞衰老凋亡是維持組織穩(wěn)態(tài)所必需的，但也可在病理狀況下被過度激活，Kim等[5]向健康小鼠肺部重復灌注凋亡的自體AT2引起肺纖維化，體內(nèi)外實驗證實巨噬細胞攝取凋亡的AT2后會向促纖維化表型轉換。Yao等[6]發(fā)現(xiàn)從IPF患者分離的AT2呈衰老狀態(tài)，并通過構建Sin3a基因敲除的小鼠模型，證明了p53和p21誘導的AT2衰老與肺纖維化的因果關系，而且抗衰老藥，達沙替尼和槲皮素對衰老AT2的干預抑制了纖維化發(fā)生。綜上，AT2衰老凋亡在IPF發(fā)生過程中有重要作用，阻斷相關通路是有希望的IPF治療方法。

維生素D的生物學作用

維生素D是一種主要由皮膚合成或從食物攝取的脂溶性維生素，先后經(jīng)位于肝腎的羥化酶羥化為活性最強的1,25-(OH)2D3。1,25-(OH)2D3與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結合后同視黃醇X受體形成異源二聚體，該復合物與靶基因啟動子區(qū)內(nèi)維生素D反應元件結合調(diào)控細胞基因轉錄。維生素D主要功能是調(diào)節(jié)鈣磷穩(wěn)態(tài)和骨代謝，近期研究表明還有抗感染、抗炎、抗纖維化作用[7]。維生素D缺乏是世界性難題，美國內(nèi)分泌學會定義血清25-(OH)2D3<20 ng/mL為維生素D缺乏，缺乏陽光照射和飲食攝入不足是維生素D缺乏的主要原因。維生素D促進AT2成熟，出生時維生素D缺乏是新生兒呼吸窘迫綜合征和支氣管肺發(fā)育不良發(fā)生的危險因素[8]。Zheng等[9]發(fā)現(xiàn)維生素D減輕肺泡上皮損傷，促進AT2增殖并抑制其凋亡。相關研究認為肺纖維化與維生素D缺乏有關，Vasilios Tzilas等[10]通過檢測93名IPF患者血清25(OH)2D3濃度發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏普遍存在，且與患者肺功能指標及死亡率密切相關，表明維生素D水平有成為IPF預后標志物的潛力。

維生素D抑制AT2衰老凋亡

AT2有一套質(zhì)量控制系統(tǒng)來應對內(nèi)外界壓力，該系統(tǒng)失效會引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、線粒體功能障礙、端粒損耗等，最終引導AT2衰老凋亡，導致肺部穩(wěn)態(tài)喪失，促進肺纖維化發(fā)生[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)維生素D可以調(diào)控以上過程延緩AT2衰老凋亡。

一、維生素D與ERS

蛋白折疊和質(zhì)量控制異常是衰老的主要特征，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊功能失調(diào)造成未折疊或折疊錯誤的蛋白大量堆積，該現(xiàn)象稱作ERS。細胞隨即調(diào)節(jié)PERK、ATF6、IRE1α三種跨膜蛋白的活性來維持蛋白穩(wěn)態(tài)，若ERS持續(xù)存在則會誘導細胞衰老凋亡[11]。研究表明皰疹病毒、吸煙、年老、基因突變均可誘發(fā)肺泡上皮細胞出現(xiàn)ERS，且ERS標志物ATF4和CHOP等，在IPF患者AT2表達增加[12]。家族性IPF患者AT2細胞SFTPC基因突變引起大量錯誤折疊的表面活性蛋白C堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終引起細胞凋亡。小鼠AT2細胞SFTPC基因C121G突變引起ERS和隨后的自發(fā)性肺纖維化，暗示ERS可能是疾病的早期驅動因素[13]。老年小鼠和IPF患者的AT2細胞中GRP78減少，GRP78是ER伴侶蛋白，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)抑制ERS，敲除小鼠GRP78基因后進行表型分析發(fā)現(xiàn)，AT2中衰老標志p53和p21、ERS標志CHOP和凋亡標志裂解的caspase-3增加。實驗揭示了GRP78缺失，誘導ERS發(fā)生，進而引起AT2細胞功能障礙和衰老凋亡，造成肺纖維化[14]。因此ERS誘導AT2衰老凋亡，在IPF發(fā)生過程中有重要作用。

維生素D在一定程度上抑制ERS，維持蛋白穩(wěn)態(tài)。秀麗隱桿線蟲是衰老研究的模型動物，蛋白穩(wěn)態(tài)喪失和不溶蛋白積聚參與其衰老，維生素D可以減少不溶蛋白積聚提升蛋白穩(wěn)態(tài)，延長秀麗隱桿線蟲壽命[15]。ERS誘導劑衣霉素處理VDR敲除小鼠，持續(xù)的ERS造成肝臟細胞凋亡和炎性因子大量釋放，但野生型小鼠VDR的激活卻減少了ERS標志物ATF6、ATF4和CHOP等在胞核周圍的積聚，因此VDR信號在調(diào)節(jié)ERS中有重要作用[16]。

二、維生素D與端粒

端粒是一段位于染色體末端的DNA-蛋白質(zhì)復合體，保護染色體末端DNA序列免于降解和重組。每次DNA復制都造成端?？s短，端粒過短會觸發(fā)DNA損傷反應，引起細胞衰老或凋亡。Snetselaar等[17]發(fā)現(xiàn)IPF患者肺部AT2細胞的端粒長度明顯變短，且端?？s短與IPF患者存活率降低相關，在家族性和散發(fā)性IPF患者中均發(fā)現(xiàn)了有關調(diào)節(jié)端粒長度的基因變異，如TERC、TERT和RTEL1等。研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶FBW7介導了BLM誘導的小鼠肺纖維化，AT2細胞內(nèi)活性增加的FBW7促進端粒保護蛋白TPP1降解，觸發(fā)端粒去帽化，引起端?？s短及DNA損傷反應、G2/M期細胞周期停滯和隨后的AT2細胞衰老，最終導致小鼠肺纖維化[18]。

白細胞端粒長度(leukocyte telomere length，LTL)已成為臨床研究端粒長度的替代物，Newton等觀察到LTL<10th的IPF患者FVC下降較快，即LTL縮短與IPF病情進展有關，因此LTL有望作為IPF患者預后標志物[19]。Julia等[20]對不同年齡段的人群進行研究發(fā)現(xiàn)，40～59歲的參與者血清25(OH)2D3濃度與LTL呈正相關。一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)維生素D充足個體的相對LTL比維生素D缺乏者的長，這可能與維生素D抗氧化作用有關[21]。但這些橫向研究不均勻，無法得出結論性的發(fā)現(xiàn)。Mohsen Mazidi等[22]用雙樣本孟德爾隨機化方法分析二者關系發(fā)現(xiàn)，血清25(OH)2D3濃度和端粒長度無關，目前二者關系仍存在爭論，需要更多研究來闡明。

三、維生素D與線粒體功能障礙

線粒體穩(wěn)態(tài)主要由線粒體自噬、線粒體融合分裂和線粒體生物合成來調(diào)節(jié)。AT2因自身代謝需求有較多線粒體，線粒體作為氧化呼吸的主要場所，其功能障礙造成大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，給胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)帶來巨大的氧化壓力，其中線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺乏組蛋白保護，更易受到ROS影響，造成異常mtDNA從受損線粒體釋放，引起細胞衰老凋亡[23]。由此可見，線粒體ROS生成和mtDNA損傷可能是肺泡上皮細胞衰老凋亡的重要原因之一，而且血清mtDNA升高也提示IPF患者預后不良[24]。當功能障礙的線粒體無法啟動自噬時，ROS生成和mtDNA損傷誘導細胞凋亡。因此自噬相關因子的水平異常被認為參與了IPF的發(fā)病過程。作為促線粒體自噬因子，PTEN誘導激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)缺乏是引起IPF患者AT2中功能障礙的線粒體自噬不足的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)化學制劑誘導A594細胞出現(xiàn)ERS，抑制了PINK1啟動子活性導致其表達降低，隨即去極化線粒體堆積引起大量ROS生成[25]。氧化應激誘導小鼠AT2細胞內(nèi)PINK1缺乏，并且PINK1基因敲除小鼠的AT2細胞的mtDNA損傷更劇烈，迫使AT2凋亡，使該小鼠較野生型更易出現(xiàn)肺纖維化[26]。因此，線粒體功能障礙及自噬不足可以誘導肺泡上皮細胞衰老凋亡增加肺纖維化易感性，在IPF的發(fā)病過程中扮演了重要角色。

VDR沉默引發(fā)呼吸爆發(fā)導致了ROS過量生成，對線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞存活造成了不利影響，揭示了VDR防止過度呼吸活動和限制ROS產(chǎn)生的新作用[27]。叔丁基過氧化氫誘導C2C12肌肉細胞產(chǎn)生過多ROS及線粒體結構和形態(tài)變化，1,25-(OH)2D3抑制了這一過程[28]，意味著維持線粒體的正常功能需要維生素D。維生素D會促進抗氧化物質(zhì)生成來拮抗ROS，1,25-(OH)2D3通過上調(diào)Nrf2減少ROS生成和DNA損傷，抑制p53/p21和p16/Rb通路來延緩細胞衰老[29]。除了抗氧化，維生素D還激活APMK/mTOR途徑促進線粒體自噬減輕乙醇誘導的肝細胞損傷，有利于清除功能障礙的線粒體和抑制細胞衰老凋亡[30]。綜上，維生素D可以通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)來抑制細胞衰老凋亡，但是目前關于線粒體功能障礙與維生素D的報道較少，仍需進一步研究。

維生素D與纖維化介質(zhì)

除了祖細胞能力受損，AT2還向衰老相關分泌表型轉變。AT2和其他細胞釋放的大量介質(zhì)以自分泌或旁分泌方式塑造促纖維化微環(huán)境，誘導肺泡上皮細胞衰老凋亡，成纖維細胞增殖分化和EMT發(fā)生，參與肺纖維化形成[31]。

一、維生素D與TGF-β1

TGF-β1是促纖維化的強力因子，與其他因子聯(lián)動促進EMT、AT2衰老凋亡、成纖維細胞分化及ECM沉積。IPF患者肺部TGF-β1升高，主要由AT2和肺泡巨噬細胞等分泌。TGF-β1與胞膜上的I、Ⅱ型受體結合使Smad2與Smad3磷酸化，與胞漿內(nèi)的Smad4結合形成Smad2/3/4復合體，進入核內(nèi)調(diào)節(jié)相應基因轉錄[32]。RanaT.等[33]發(fā)現(xiàn)TGF-β1激活p16/pRb通路誘導AT2衰老和分泌大量纖維化介質(zhì)。此外，衰老的AT2表達整合素αvβ6，激活TGF-β1促進纖維化。因此TGF-β1在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

維生素D抑制肺纖維化的作用與TGF-β1/Smad通路有關。Li團隊[34]發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏小鼠和Cyp27b1基因敲除小鼠經(jīng)BLM處理后肺部TGF-β/Smad2/3通路較對照組明顯激活，且纖維化程度加重，說明維生素D缺乏放大了TGF-β/Smad信號通路。Smad7是TGF-β/Smad通路的抑制劑，維生素D減少Smad3表達并上調(diào)Smad7抑制纖維化[35]。除此之外，TGF-β1刺激下的人支氣管成纖維細胞表現(xiàn)出很強的致纖維化能力。1,25-(OH)2D3顯著抑制了該效應，并通過阻滯細胞周期來抑制TGF-β1誘導的人支氣管成纖維細胞增殖[36]。以上研究表明維生素D有作為肺纖維化輔助治療藥物的潛力。

二、維生素D與局部血管緊張素系統(tǒng)

局部血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)參與了肺纖維化，矽肺大鼠模型肺組織中血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)表達升高，SiO2處理的成纖維細胞血管緊張素II ～1型受體(Angiotensin II type 1 receptors，AT1R)表達增加[37]。血管緊張素II(Angiotensin II，AngII)與AT1R結合誘導肺泡上皮細胞凋亡，并激活MAPK和Smads通路，促進TGF-β1等促纖維因子表達及膠原蛋白沉積引起肺纖維化[38-39]。而且大量動物實驗證明ARB和ACEI類藥物有減輕肺纖維化的作用。以上均說明RAS在肺纖維化中扮演重要角色。

維生素D是RAS的負性調(diào)節(jié)劑，骨化三醇調(diào)節(jié)ACE/ACE2平衡，抑制RAS過度表達，延緩腎臟纖維化進展[40]。長期缺乏維生素D的小鼠肺泡結構破壞甚至塌陷，肺泡間隔變厚呈纖維化表現(xiàn)，且肺部ACE / Ang II / AT1R軸過度表達，即維生素D缺乏誘導RAS失衡，引發(fā)纖維化級聯(lián)反應導致小鼠肺纖維化[41]。

維生素D與EMT

EMT是上皮細胞喪失極性和細胞間緊密連接轉化為具有間質(zhì)細胞特性的過程。TGF-β/Smad與wnt/β-catenin等多種通路，激活調(diào)節(jié)轉錄因子，抑制上皮細胞標志物E-cadherin轉錄,增加間質(zhì)細胞標志物轉錄，使細胞形態(tài)改變并獲得遷移侵襲能力[42]。持續(xù)的微小損傷誘導肺泡上皮細胞釋放大量因子招募活化肌成纖維細胞，AT2上皮間質(zhì)轉化是肌成纖維細胞的來源之一[1, 43]。

TGF-β與Wnt通路在組織修復過程中誘導AT2上皮間質(zhì)轉化，維生素D通過抑制TGF-β經(jīng)典途徑阻止EMT[9]。FZDs與LRP5/6形成的跨膜受體和Wnt結合抑制β-catenin降解，使其堆積于胞內(nèi)并向細胞核轉位。胞核內(nèi)，β-catenin 與TCF/LEF結合調(diào)節(jié)特定基因轉錄。維生素D對wnt/β-catenin通路的作用在結直腸癌中研究較多[44]：(1)1,25-(OH)2D3與核VDR結合后誘導β-catenin/VDR復合物形成阻止β-catenin與TCF/LEF結合；(2)1,25-(OH)2D3促進CDH1基因產(chǎn)物E-cadherin表達，E-cadherin 會把β-catenin固定在細胞間黏附連接阻止其核轉位；(3)1,25-(OH)2D3促進wnt抑制劑DKK1表達。上述維生素D拮抗wnt的機制對肺纖維化研究有一定借鑒之處，Sari等發(fā)現(xiàn)[35]維生素D增加了經(jīng)香煙煙霧提取物和TGF-β處理的A549細胞中DKK1表達，降低了p-Smad2/3、Smad4與β-catenin的水平，阻止其調(diào)節(jié)EMT靶基因轉錄，使E-cadherin免于降解，最終抑制實驗組A549細胞向間質(zhì)細胞轉化。因此，適當補充維生素D可以抑制EMT，延緩纖維化進展。

展 望

維生素D是人體必需的維生素，眾多研究發(fā)現(xiàn)維生素D抑制AT2衰老凋亡、拮抗肺纖維化。因此，適當補充維生素D可延緩IPF進展，有望成為IPF輔助治療藥物。未來應通過大樣本、前瞻性及對照研究，探討合適劑量及治療時長。