慢病毒介導(dǎo)的microRNA-19b表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及Wnt/β-catenin信號(hào)的影響

王申，金建平，夏兵華，常濤

（蘇州市第九人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，江蘇 蘇州 215200）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，具有生長(zhǎng)隱匿、不易早期診斷、較早發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多途徑、多階段、多機(jī)制積累及多遺傳變異的復(fù)雜過(guò)程。抑癌基因失活、癌基因激活及其之間的互作失衡是鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制[1-3]。因此，尋找影響鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因，并進(jìn)一步研究其機(jī)制，對(duì)該病的診療具有重要意義。microRNA（miRNA）是一類(lèi)非編碼的小分子RNA，可控制細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等多種生物進(jìn)程，在腫瘤中充當(dāng)癌基因或抑癌基因作用，并可調(diào)控下游的一些靶基因影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。多項(xiàng)研究表明，miRNAs 異常表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。miR-19b 是miRNAs 家族中的一員，有研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中miR-19b 的表達(dá)升高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等有關(guān)，可能作為潛在的鼻咽癌診斷標(biāo)志物[7]。鼻咽癌患者血清中miR-19b 表達(dá)水平升高。研究提示miR-19b 可能在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。有研究表明，miR-19b-3p 可通過(guò)靶向TNFAIP3/NF-κB 調(diào)控鼻咽癌放療敏感性[9]。但目前miR-19b 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制尚未明確。因此，本研究旨在抑制或表達(dá)miR-19b 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HONE1 增殖凋亡的影響，并進(jìn)一步研究引起細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2018年8月蘇州市第九人民醫(yī)院收治的鼻咽癌患者40 例作為研究對(duì)象，同時(shí)收集癌旁組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)均為鱗癌。其中，男性27 例，女性13 例；年齡19～85 歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療及其他治療，且均為首次確診，研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69 及鼻咽癌細(xì)胞系HONE1、5-8F 和CNE1 購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。miR-19b 抑制表達(dá)（miR-19b inhibitor）、miR-19b 過(guò)表達(dá)和無(wú)意義序列（Scrambled）的慢病毒載體（miR-19b mimics）由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建。MTT 及RNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，Annexin V-APC 和7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑及流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，Ki-67、p53、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體，細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）和C-myc購(gòu)自美國(guó)Cell signal 公司，PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Labsystem 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 細(xì)胞在含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 鼻咽癌組織及細(xì)胞中miR-19b 的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。Trizol 法提取鼻咽癌細(xì)胞及組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄總RNA 為cDNA，以cDNA 為模板，使用qRT-PCR 儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為20μl。PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照PCR 反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)。以U6 作為內(nèi)參基因，根據(jù)反應(yīng)所得Ct 均值，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-19b 相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)量。

1.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染HONE1 細(xì)胞 構(gòu)建miR-19b 抑制表達(dá)（miR-19b inhibitor 組）、miR-19b 過(guò)表達(dá)（miR-19b mimics 組）和無(wú)意義序列（Scrambled 組）的慢病毒載體，并設(shè)定空白組。以最佳的MOI 值轉(zhuǎn)染 HONE1細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞參照慢病毒包裝與使用工具手冊(cè)，收集慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功的細(xì)胞，參照1.3.2 方法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-19b mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。胰酶消化HONE1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103個(gè)/ 孔，按200 μl/孔接種于96 孔板，接種24 h 后將空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后的24、48 和72 h 收集細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，置于37℃培養(yǎng)6 h，棄掉上清液，每孔中加入DMSO 200 μl，輕微震蕩混勻20 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處各孔的吸光度值（A 值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為6×104個(gè)/ml，鋪細(xì)胞于6 孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 后加入干擾素-α（IFN-α）（10 000 IU/ml），72 h 后采用Annexin V-APC 和7-AAD 雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。具體操作參照試劑盒。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和c-myc蛋白表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞中加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每泳道取等量的蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，電轉(zhuǎn)好的PVDF 膜置于封閉液中2 h，洗膜，加入一抗4℃過(guò)夜，一抗Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc均按照1∶500稀釋，內(nèi)參GAPDH按照1∶1 000稀釋，洗膜，次日加入二抗，洗膜后常溫孵育二抗（1∶2 000 稀釋HRP 標(biāo)記的羊抗兔）2 h，洗膜，顯色液顯色，暗室環(huán)境進(jìn)行壓片、顯影、定影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，多組間進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-19b 在鼻咽癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

以癌旁組織中miR-19b 的表達(dá)及人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69 中miR-19b 的表達(dá)為1，qRT-PCR 結(jié)果顯示，鼻咽癌組織miR-19b 表達(dá)為（5.13±0.52），高于癌旁組織表達(dá)（1.01±0.10）（t=48.847，P=0.000）；NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 細(xì)胞中miR-19b 表達(dá)分別為（1.00±0.00）、（6.63±0.61）、（5.15±0.51）和（5.63± 0.50），4 組細(xì)胞miR-19b 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=83.447，P=0.000），鼻咽癌細(xì)胞中miR-19b 表達(dá)高于NP69 細(xì)胞（HONE1：t=255.188，P=0.000；5-8F：t=114.085，P=0.000；CNE1：t=259.424，P=0.000）。選取HONE1 細(xì)胞作為研究對(duì)象。見(jiàn)圖1、2。

2.2 miR-19b 在HONE1 細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)抑制或過(guò)表達(dá)miR-19b后HONE1 細(xì)胞miR-19b 的表達(dá)情況，與空白組（1.00±0.16）比較，Scrambled 組、miR-19b inhibitor 組、miR-19b mimics組細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)分別為（1.03± 0.02）、（0.22±0.02）和（4.52±1.13），4 組細(xì)胞miR-19b 的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.011，P=0.000）。Scrambled 組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.104，P=0.763），與空白組比較，miR-19b inhibitor 組miR-19b 的表達(dá)降低（t=70.200，P=0.001），miR-19b mimics 組miR-19b 的表達(dá)升高（t=28.538，P=0.006）。見(jiàn)圖3。

圖1 miR-19b 在鼻咽癌及癌旁組織中的表達(dá)（±s）

圖2 miR-19b 在4 種細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

圖3 miR-19b 在各組細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

2.3 miR-19b 對(duì)HONE1 細(xì)胞活力的影響

通過(guò)MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組24 h 的OD 值分別為（0.61±0.06）、（0.56±0.06）和（0.78±0.07），48 h 的 OD 值分別為（0.80±0.09）、（0.43±0.05）和（1.34± 0.13），72 h 的OD 值分別為（0.85±0.10）、（0.31±0.04）和（1.89±0.22），3組24、48、72 h 的OD 值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD 值有差異（F=255.817，P=0.004）；②3組的OD值有差異（F=164.528，P=0.006）；③3組的OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=141.676，P=0.007）。與空白組比較，miR-19b inhibitor 組在48 和72 h 細(xì)胞活力降低（t=41.656 和88.657，P=0.003 和0.001），而miR-19b mimics組在48 和72 h 細(xì)胞活力升高（t=38.009 和55.721，P=0.004 和0.001）。見(jiàn)圖4。

2.4 miR-19b 對(duì)HONE1 細(xì)胞凋亡的影響

圖4 各組不同時(shí)間的OD 值比較（±s）

采用Annexin V-APC 和7-AAD 雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組細(xì)胞凋亡率分別為（12.88±1.32）%、（19.17±1.45）%和（6.21±0.74）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.061，P=0.000）；與空白組比較，miR-19b inhibitor 組細(xì)胞凋亡率升高（t=30.870，P=0.005），miR-19b mimics 組細(xì)胞凋亡率降低（t=58.282，P=0.002）。見(jiàn)圖5、6。

2.5 miR-19b 對(duì)HONE1 細(xì)胞Ki-67、p53、β- catenin，Cyclin D1 和C-myc 表達(dá)的影響

Western blotting 檢測(cè)各組細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白Ki-67、凋亡相關(guān)蛋白p53 及β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc 的蛋白表達(dá)，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組Ki-67 蛋白表達(dá)量分別為（0.29± 0.03）、（0.12±0.02）和（0.48±0.06），p53 蛋白表達(dá)量分別為（0.13±0.02）、（0.25±0.03）和（0.05±0.01），β-catenin 蛋白表達(dá)量分別為（0.16±0.020）、（0.09± 0.01）和（0.36±0.04），Cyclin D1 蛋白表達(dá)量分別為（0.25±0.03）、（0.11±0.01）和（0.41±0.05），C-myc 蛋白表達(dá)量分別為（0.30±0.03）、（0.11±0.01）和（0.44±0.04）；3組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1和C-myc 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.769、88.383、53.133、70.783 和83.650，P=0.000、0.000、0.002、0.000 和0.000）；與空白組比較，miR-19b inhibitor 組Ki-67 和β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達(dá)降低（t=59.769、76.568、63.362 和83.465，P=0.000、0.000、0.001和0.001），p53 的表達(dá)升高（t=45.522，P=0.003）；與空白組比較，miR-19b mimics 組Ki-67、β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達(dá)升高（t=23.458、53.133、29.546 和83.450，P=0.008、0.002、0.006 和0.000），p53 的表達(dá)降低（t=47.041，P=0.002）。見(jiàn)圖7、8。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示各組的細(xì)胞凋亡情況

圖6 各組的細(xì)胞凋亡率的比較（±s）

圖7 各組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白的表達(dá)（Western blotting）

圖8 各組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

3 討論

MicroRNA（miRNA）由22～25 個(gè)核苷酸組成，是一種內(nèi)源性的單鏈非編碼小分子RNA，在腫瘤中可能是一類(lèi)潛在的癌基因或抑癌基因，可通過(guò)與靶基因的配對(duì)結(jié)合而調(diào)控靶基因表達(dá)[10]。目前已有大量研究證實(shí)，miRNAs 表達(dá)及功能失調(diào)影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展[11-12]。有研究顯示，miR-143 能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z 的增殖、遷移和侵襲能力[13]。miR-324-3p可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT 改變調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[14]。提示miRNAs 可能對(duì)鼻咽癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要意義。miR-19b 是miRNAs 家族中的一員，可影響多種腫瘤的生物學(xué)過(guò)程[15]，在鼻咽癌中表達(dá)升高，但對(duì)其生物學(xué)特性研究還未清楚。

本研究中抑制或過(guò)表達(dá)miR-19b 的慢病毒轉(zhuǎn)染EBV 陰性鼻咽癌細(xì)胞系HONE1，獲得穩(wěn)定的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞后，通過(guò)MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)IFN-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，抑制miR-19b 表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞活力降低，凋亡率增加，而過(guò)表達(dá)miR-19b 的鼻咽癌細(xì)胞活力升高，凋亡率降低。提示miR-19b 對(duì)鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的影響。Ki-67 是一個(gè)可標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，與多種腫瘤的增殖有密切關(guān)系，能可靠和全面地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，目前已在細(xì)胞增殖研究中有廣泛應(yīng)用[15]。Ki-67在鼻咽癌中的研究相對(duì)較少，但有研究發(fā)現(xiàn)其可影響鼻咽癌細(xì)胞增殖，且可作為鼻咽癌預(yù)后判斷的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[16]。p53是一個(gè)重要的抑癌基因，有啟動(dòng)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期等作用，其失活是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要事件[17]。鼻咽癌中p53 的活化可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[18]。為檢測(cè)miR-19b 引起鼻咽癌增殖凋亡的機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)miR-19b 對(duì)Ki-67和p53 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，抑制miR-19b 表達(dá)可下調(diào)Ki-67 表達(dá)，上調(diào)p53 表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-19b可上調(diào)Ki-67 表達(dá)，下調(diào)p53 表達(dá)。提示miR-19b 可通過(guò)調(diào)節(jié)Ki-67 和p53 表達(dá)影響鼻咽癌增殖和凋亡。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程的調(diào)控，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，且在多種腫瘤中出現(xiàn)異常激活[19-20]。抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可降低鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)[21-22]。本研究檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制鼻咽癌中miR-19b 的表達(dá)可下調(diào)β-catenin、Cyclin D1 和c-myc 的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-19b 可上調(diào)β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 表達(dá)。提示miR-19b 可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路降低鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，抑制miR-19b 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌HONE1 細(xì)胞可降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及下調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，降低細(xì)胞活力方式是下調(diào)Ki-67 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式是上調(diào)p53 表達(dá)，而轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-19b 載體反之。本研究提示miR-19b可能是鼻咽癌診療的一個(gè)有效的分子靶點(diǎn)。