ELISA檢測(cè)KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體的方法建立及作為RA診斷的應(yīng)用價(jià)值

周 瑩，管曉龍，李曉軍，虞 偉，管世鶴，

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院檢驗(yàn)科，合肥 230001；3.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，南京 210002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種具有高度異質(zhì)性的自身免疫性疾病，其特征在于組織損傷、慢性炎癥和骨質(zhì)破壞，甚至累及關(guān)節(jié)外器官(包括心臟，肺等)，導(dǎo)致預(yù)期壽命縮短[1]?？构习彼峄鞍卓贵w(anti-citrullinated proteins antibodies，ACPA)是所有能識(shí)別瓜氨酸修飾蛋白的抗體統(tǒng)稱[2]?？弓h(huán)瓜氨酸化肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體在2010年被納入RA分類標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷和病情監(jiān)測(cè)[3-4]，但抗CCP抗體對(duì)RA的診斷仍有約20%的漏診率，且尚未有研究鑒定出具體哪些瓜氨酸化自身抗原在RA發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。目前，已有四種瓜氨酸化自身抗原得到驗(yàn)證，包括纖維蛋白原、波形蛋白、II型膠原蛋白和α-烯醇化酶[5]。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)、肽芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)RA關(guān)節(jié)滑膜組織及RA血清免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化蛋白進(jìn)行鑒定和分析，以期完善RA特異性瓜氨酸化抗原譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，角蛋白I型細(xì)胞骨架10(keratin type I cytoskeletal 10，KRT10)和VI型膠原蛋白A3[collagen alpha-3(VI) chain，COL6A3]與RA具有較高相關(guān)性。因此，本研究篩選了KRT10和COL6A3的原始肽和瓜氨酸修飾肽作為靶抗原，共合成了四種短肽，以臨床常規(guī)檢測(cè)的抗CCP抗體陽(yáng)性和陰性血清進(jìn)行抗體結(jié)合活性驗(yàn)證，初步建立起KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體檢測(cè)的ELISA方法，并探討該兩種短肽抗體在作為RA潛在診斷靶標(biāo)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年4～12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院就診并進(jìn)行抗CCP抗體檢測(cè)的患者血清共229例，當(dāng)血清抗CCP抗體>5U/ml時(shí)，則認(rèn)為該血清中含有抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)。ACPA陽(yáng)性組100例，男性31例，女性69例，平均年齡58±16.2歲；健康對(duì)照組100例，男性43例，女性57例，平均年齡39±28.7歲；另有臨床明確診斷為RA的患者29例，其中抗CCP抗體陽(yáng)性者19例，抗CCP抗體陰性者10例，平均年齡51±13.7歲。血清無(wú)脂血、溶血等不合格情況，收集于干燥潔凈EP管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 短肽粉末(上海強(qiáng)耀生物有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、雙蒸水、PBS緩沖液(博士德生物有限公司)，吐溫20(北京Solarbio科技有限公司)，顯色液與終止液(上海科華生物工程股份有限公司)，ELISA酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 短肽合成：由上海強(qiáng)耀生物有限公司提供，共合成4條短肽，短肽序列如下：原始短肽KRT10： RLAADDF-R-LKYENEV，修飾短肽KRT10-C： RLAADDF-(Cit)-LKYENEV，原始短肽COL6A3： QDVVNAV-R-QLTLLGG，修飾短肽COL6A3-C：QDVVNAV-(Cit)-QLTLLGG。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟：每管短肽粉末(1mg)加入500 μl DMSO及500 μl CBS溶解至清澈無(wú)渾濁，得到1mg/ml的短肽溶液，4℃冰箱備用。①包被：將1mg/ml短肽溶液和PBST按1∶200比例稀釋為5μg/ml，每孔100μl，37℃水浴箱孵育1h，4℃冰箱過(guò)夜，用PBST洗滌，拍干，重復(fù)4次；②封閉：牛血清清蛋白(PBST溶解為1 ml/dl)每孔150 μl，37℃水浴箱孵育1h，4℃冰箱過(guò)夜，用PBST洗滌，拍干，重復(fù)4次；③加血清樣本：1ml/dl牛血清清蛋白與樣本血清按1∶50比例稀釋，每孔100 μl，37℃水浴箱孵育1h，用PBST洗滌，拍干，重復(fù)4次；④加二抗：分別采用HRP標(biāo)記兔抗人IgA，IgG與IgM按1∶3 000稀釋，每孔100 μl，37℃水浴箱孵育1h，用PBST洗滌，拍干，重復(fù)5次；⑤顯色與終止：加入底物A液2滴和B液2滴，避光顯色4 min，加終止液2滴終止反應(yīng)；⑥讀板：A630nm/A450nm雙波長(zhǎng)讀取吸光度A值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣本之間采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。兩種短肽抗體對(duì)于RA診斷的應(yīng)用價(jià)值采用ROC曲線進(jìn)行評(píng)估。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ACPA與四種短肽抗原的結(jié)合反應(yīng) 對(duì)100例ACPA陽(yáng)性組及100例健康對(duì)照組進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，表2。以抗人IgA，IgG為二抗時(shí)，陽(yáng)性組的四種短肽抗原檢測(cè)值均高于相應(yīng)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。以抗人IgM為二抗時(shí)，陽(yáng)性組COL6A3和COL6A3_C檢測(cè)值與相應(yīng)對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 RA確診血清與四種短肽的ELISA檢測(cè)結(jié)果 對(duì)確診RA患者血清[RA抗CCP抗體(+)組19例，RA抗CCP抗體(-)組10例]進(jìn)行ELISA檢測(cè)。以抗人IgG為二抗時(shí)，RA抗CCP抗體(+)組KRT10_C檢測(cè)值(0.82±0.058)明顯高于其他組檢測(cè)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以抗人IgM為二抗時(shí)，RA抗CCP抗體(-)組COL6A3_C檢測(cè)值(0.41±0.043)明顯高于其他組檢測(cè)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 KRT10和KRT10_C吸光度A值

表2 COL6A3和COL6A3_C吸光度A值

2.3 兩種瓜氨酸化短肽抗體用于RA診斷的效果評(píng)價(jià) KRT10_C在RA抗CCP抗體(+)組檢測(cè)值較高，COL6A3_C在RA抗CCP抗體(-)組檢測(cè)值較高。因此，篩選KRT10_C(以抗人IgG為二抗)和COL6A3_C(以抗人IgM為二抗)用于RA診斷并進(jìn)行價(jià)值評(píng)價(jià)。依據(jù)100例健康對(duì)照組血清檢測(cè)KRT10_C短肽抗體(以抗人IgG為二抗)與COL6A3_C短肽抗體(以抗人IgM為二抗)的吸光度A值，取+2s確定KRT10_C短肽抗體(以抗人IgG為二抗)的cut-off值為0.5，COL6A3_C短肽抗體(以抗人IgM為二抗)的cut-off值為0.2。

KRT10_C短肽抗體的ELISA檢測(cè)(以抗人IgG為二抗)用于RA患者診斷的靈敏度為58.62%，特異度為52.17%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值60.71%，陰性預(yù)測(cè)值52.17%，ROC曲線下面積為0.686，見(jiàn)圖1A。該類抗體僅用于診斷抗CCP抗體(+)RA患者時(shí)診斷的ROC曲線下面積可達(dá)0.895，見(jiàn)圖1B。

圖1 KRT10_C短肽抗體用于診斷RA的ROC曲線

與臨床診斷相比，COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測(cè)值用于RA患者診斷的靈敏度為65.52%，特異度為78.95%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值82.61%，陰性預(yù)測(cè)值60%，ROC曲線下面積為0.724，見(jiàn)圖2C。有趣的是，該短肽抗體僅用于診斷抗CCP抗體(-)的RA患者準(zhǔn)確性有很大提高，ROC曲線下面積可達(dá)0.956，見(jiàn)圖2D。

圖2 COL6A3_C短肽抗體用于診斷RA的ROC曲線

2.4 精密度評(píng)價(jià) 取ACPA低濃度(<0.05 U/ml)、中濃度(97.2U/ml)和高濃度(>200U/ml)患者血清各一份，以上述ELISA方法重復(fù)檢測(cè)20次，包被KRT10_C的ELISA檢測(cè)值(以抗人IgG為二抗)的批內(nèi)變異系數(shù)分別為11.2%，7.8%和6.7%。COL6A3_C對(duì)RA(-)組檢測(cè)意義較大，RA(-)組無(wú)ACPA參照，因此取RA(-)組COL6A3_C低濃度(A值<0.2)、中濃度(A值=0.456)和高濃度(A值>0.6)患者血清各一份，以上述ELISA方法重復(fù)檢測(cè)20次，包被COL6A3_C的ELISA檢測(cè)(以抗人IgM為二抗)的批內(nèi)變異系數(shù)分別為12.9%，8.4%和8.9%。

3 討論

本研究篩選了兩種短肽及其瓜氨酸修飾肽段作為ELISA檢測(cè)的靶抗原，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示四種短肽與ACPA陽(yáng)性組的結(jié)合活性高于健康對(duì)照組(以抗人IgA，IgG為二抗)，說(shuō)明四種短肽與RA具有較高相關(guān)性。通過(guò)比較ELISA檢測(cè)結(jié)果和臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)告發(fā)現(xiàn)，KRT10_C短肽抗體的檢測(cè)值(以抗人IgG為二抗)較高的血清樣本的抗CCP抗體濃度水平也較高(多數(shù)濃度值>200U/ml)，提示該短肽抗體可能與抗CCP抗體濃度值存在正相關(guān)性。

角蛋白屬于中間絲蛋白的超家族，主要分為兩組：28種I型酸性蛋白質(zhì)和26種II型堿性蛋白質(zhì)。 I型和II型角蛋白形成異二聚體，用于組裝10nm細(xì)絲，為維持細(xì)胞完整性提供結(jié)構(gòu)支持[6]。角蛋白作為一種多方面的細(xì)胞骨架蛋白，主要在上皮細(xì)胞的基底細(xì)胞中表達(dá)，可調(diào)節(jié)多種的生物過(guò)程，包括維持細(xì)胞完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移、以及減緩細(xì)胞凋亡。促炎細(xì)胞因子包括IL-17，IL-22，IFN-3，TGF-β，Nrf2和p53可通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控角蛋白表達(dá)。此外，磷酸化和泛素化等蛋白翻譯后修飾參與調(diào)節(jié)角蛋白功能和穩(wěn)定性[7-8]。在角蛋白與RA相關(guān)性的前期研究中，NIENHUIS等[9-10]發(fā)現(xiàn)抗核周因子對(duì)頰黏膜細(xì)胞核周圍的角質(zhì)透明顆粒具有反應(yīng)性，抗核周因子在RA中具有特異性表達(dá)，但由于復(fù)雜的免疫熒光技術(shù)、選擇標(biāo)本的繁瑣和實(shí)驗(yàn)室間難以標(biāo)準(zhǔn)化，因而沒(méi)有被廣泛使用。此后，其他研究者發(fā)現(xiàn)抗核周因子與頰黏膜細(xì)胞中的絲聚蛋白特異性單克隆抗體共定位，并通過(guò)抗核周因子作為抗原和相關(guān)抗角蛋白抗體的生化特性得到證實(shí)和擴(kuò)展，因此抗角蛋白抗體應(yīng)該更準(zhǔn)確地稱為“抗絲聚蛋白抗體”，被用于RA實(shí)驗(yàn)室診斷與研究中[11]。在本次以抗人IgG為二抗的ELISA實(shí)驗(yàn)中，KRT10_C較KRT10與ACPA結(jié)合活性升高。與其他組相比，抗KRT10_C短肽抗體在RA抗CCP抗體(+)組檢測(cè)值較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，KRT10_C短肽抗體僅用于診斷RA抗CCP抗體(+)的ROC曲線下面積為0.895，可見(jiàn)KRT10_C短肽抗體對(duì)RA抗CCP抗體(+)患者的診斷價(jià)值較高。

VI型膠原蛋白珠狀微纖維存在于幾乎所有組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，與皮膚、腎臟、神經(jīng)、血管和肌肉中的基底膜密切相關(guān)[12]，被認(rèn)為是基底膜與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)錨定的主要作用物。在肌腱和角膜中，VI型膠原蛋白微纖維分布在肌腱纖維周圍；在軟骨中，細(xì)胞周圍基質(zhì)富含VI型膠原蛋白微纖維，可保護(hù)軟骨細(xì)胞，減輕關(guān)節(jié)壓力。VI型膠原蛋白通過(guò)與各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相互作用來(lái)促進(jìn)這些橋接和錨定作用，包括其他膠原蛋白、蛋白多糖、纖連蛋白和微纖維相關(guān)糖蛋白1(MAGP1)[13]。同時(shí)，LAMANDE等[14]也發(fā)現(xiàn)VI型膠原蛋白缺乏會(huì)改變細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激增加，肌肉再生受損，RA中VI型膠原蛋白被瓜氨酸化修飾，極有可能因此影響了蛋白結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生了與VI型膠原蛋白缺乏類似的生物學(xué)效應(yīng)。

以抗人IgG為二抗的實(shí)驗(yàn)中， COL6A3瓜氨酸修飾之后，與ACPA結(jié)合活性降低，提示并非所有瓜氨酸修飾后肽段與ACPA的結(jié)合活性都是升高的，有些蛋白的瓜氨酸修飾形式與ACPA的結(jié)合活性反而降低。但是，在確診RA但抗CCP抗體陰性的血清實(shí)驗(yàn)(以抗人IgM為二抗)中，COL6A3_C短肽抗體的檢測(cè)值較其他組高。由此我們不禁猜想：當(dāng)COL6A3為靶抗原時(shí)，極有可能產(chǎn)生IgM類抗體，而大多臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ACPA的二抗為抗IgG抗體，因而檢測(cè)不出IgM類COL6A3的抗體值，這可能是臨床實(shí)驗(yàn)室診斷中RA患者出現(xiàn)抗體漏檢的重要原因。初步研究表明，COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測(cè)用于診斷抗CCP抗體陰性RA患者的ROC曲線下面積可達(dá)0.956，具有較高診斷價(jià)值，將有可能作為抗CCP抗體的有效補(bǔ)充。

綜上，KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測(cè)，可完善RA實(shí)驗(yàn)室診斷體系，提高RA早期診斷率，對(duì)降低RA疾病晚期致殘致畸率具有重要意義。同時(shí)，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以期獲得更可靠的應(yīng)用數(shù)據(jù)。