甲狀腺乳頭狀癌并發(fā)橋本氏甲狀腺炎患者BRAF-V600E基因表達(dá)及T淋巴細(xì)胞亞群分析

孟凡萍，郝 坡，范 慧

(1.重慶三峽中心醫(yī)院 ，重慶 404000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 ，重慶 400020)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC) 是頭頸部最常見的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，其中最多的是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，占TC的70%～80%，在過去的十年中，PTC的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。由于PTC患者中很大一部分并發(fā)橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)，故學(xué)者們認(rèn)為HT與PTC存在很大的相關(guān)性。HT屬于器官特異性免疫性甲狀腺疾病，近年來發(fā)病已高達(dá)(22.5～40.7)/10萬。該病有癌變的可能性，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前多數(shù)人認(rèn)為該病的癌變與患者的基因突變與免疫狀態(tài)等多種因素相關(guān)。BRAF基因在人體7號(hào)染色體上，是人類最重要的原癌基因之一，大約8%的人類腫瘤發(fā)生BRAF突變， V600E是BRAF基因最常見的一個(gè)突變位點(diǎn)，主要發(fā)生在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌中，該突變導(dǎo)致下游MEK-ERK信號(hào)通路持續(xù)激活，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。大量的研究證實(shí)，BRAF-V600E基因突變與甲狀腺癌的診斷、治療和判斷預(yù)后都有重要聯(lián)系。BRAF-V600E基因診斷PTC的特異度幾乎可達(dá)100%。HT是細(xì)胞免疫功能紊亂導(dǎo)致，T淋巴細(xì)胞亞群代表著機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，故本次研究通過研究PTC，PTC并發(fā)HT，單純HT患者BRAF-V600E基因的表達(dá)以及外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化特征，探討其BRAF-V600E基因的突變率以及機(jī)體的免疫狀態(tài)，旨在為二者之間的聯(lián)系提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年9月～2019年8月于本院就診的單純PTC患者(PTC 組)45例、單純HT患者(HT組)55例、PTC并發(fā)HT患者(PTC-HT組)42例，以健康體檢者(NC組)患者50例為對(duì)照，年齡21～72歲，平均年齡45.7歲。所有病例均經(jīng)過病理證實(shí)，臨床資料完整，排除其他腫瘤，以及對(duì)本研究所涉及疾病有影響的其他疾病，患者亦未接受過免疫治療。

1.2 試劑和儀器 核酸提取試劑、人類BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)為廈門艾德生物醫(yī)藥科技公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)life公司，淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒、BD FAS CALIBUR 流式細(xì)胞分析儀以及FCAP CELLQUEST分析軟件為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 人類BRAF-V600E基因突變的檢測(cè)：樣本總DNA的提?。?92例患者均經(jīng)穿刺取新鮮甲狀腺組織，經(jīng)5 g/dl福爾馬林固定后，用吸附柱法提取樣本總DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，確保其A260nm/A280 nm在1.8～2.0內(nèi)。

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)測(cè)定：PCR操作、反應(yīng)過程及結(jié)果判定按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，并設(shè)立陽性質(zhì)控品和陰性對(duì)照，共同進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3.2 人T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè):采集各組受試者靜息狀態(tài)下外周血標(biāo)本2ml，經(jīng)EDTA-K2抗凝后上機(jī)檢測(cè)，用流式細(xì)胞術(shù)來分析各組受試者T淋巴細(xì)胞亞群分布，用CD3+(PE標(biāo)記)、CD4+(PerCP標(biāo)記)、CD8+(FITC標(biāo)記)分別設(shè)門，分別圈出陽性細(xì)胞后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析，計(jì)算CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD8+T細(xì)胞數(shù)，以及CD4+/CD8+比值。

2 結(jié)果

2.1 PTC組、HT組、PTC+HT組和NC組 BRAF-V600E突變率 PTC 組、HT組、TC-HT組BRAF-V600E的突變率分別為48.15%(26/54)，1.81%(1/55)，66.67%(28/42)，而NC組BRAF-V600E未突變。

2.2 PTC組、HT組、PTC+HT組和NC組T淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果 見表1。 通過三個(gè)觀察組與NC組的比較和觀察組之間的比較可知，三個(gè)觀察組CD8+均比NC組顯著升高，CD4+均比NC組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTC組患者CD4+顯著低于HT組(P<0.05)和PTC-HT組，PTC-HT組CD4+又顯著低于HT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三個(gè)觀察組CD4+/CD8+均比NC組顯著下降，其中PTC組下降最顯著， 其次是PTC-HT組、HT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

PTC是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，且患病率逐年上升。其發(fā)生機(jī)制可能與機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、免疫功能紊亂和基因突變有密切關(guān)系[1]。有報(bào)道，近年來，HT伴PTC發(fā)生率高達(dá)58.3%，可見橋本氏甲狀腺炎與癌變有非常大的關(guān)系[2-3]。HT是常見的自身免疫性甲狀腺疾病，其主要特征是體內(nèi)出現(xiàn)特異性甲狀腺抗體，甲狀腺組織中存在著大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，最終引起甲狀腺組織結(jié)構(gòu)破壞，造成甲狀腺功能低下。HT的癌變問題是近年來醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，但發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為HT是PTC的危險(xiǎn)因素[4]，也有學(xué)者認(rèn)為HT對(duì)于PTC是一種保護(hù)因素[5]。本研究就是基于PTC的發(fā)病機(jī)制，通過研究PTC，PTC-HT，單純HT患者的BRAF-V600E基因的突變率以及T淋巴細(xì)胞亞群的變化，探索HT與PTC之間的相互關(guān)系。

BRAF基因是一個(gè)非常重要的原癌基因，該基因位于人類7號(hào)染色體上，編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK/ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，與PTC、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌以及黑色素瘤等相關(guān)[6]，BRAF-V600E在甲狀腺其他腫瘤中幾乎未見突變，而僅在PTC中有突變，可以說BRAF-V600E基因突變是PTC診斷的特異性標(biāo)志物[7]。有研究報(bào)道，BRAF-V600E位點(diǎn)的突變與PTC的侵襲性、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，BRAF-V600E不僅可啟動(dòng)正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞腫瘤發(fā)生，還能維持和促進(jìn)PTC的侵襲性[8]。本研究顯示，PTC 組患者BRAF V600E突變率48.15%，PTC并發(fā)HT組為66.67%，PTC并發(fā)HT后，突變率高于單純PTC組，而單純HT組患者BRAF-V600E突變率僅為1.81%，這與大部分學(xué)者研究結(jié)論相符，提示BRAF-V600E突變與HT是否發(fā)生癌變有關(guān)，BRAF-V600E可能是HT發(fā)生癌變的危險(xiǎn)因素。該基因位點(diǎn)不僅可作為甲狀腺腫瘤良惡性的鑒別，還有助于后續(xù)綜合治療，以及以該基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物研發(fā)。

注：a與NC相比較；b與HT組比較；c與PTC-HT組比較。

HT是一種免疫性疾病，在人類自身免疫過程中，T細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫與PTC以及HT的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系[9-10]。輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Ts)是T細(xì)胞的兩個(gè)亞型，前者表達(dá)CD4+，后者表達(dá)CD8+，二者共同維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定性，常用CD4+/CD8+的比值來衡量機(jī)體的免疫狀態(tài)，一般此比值維持在1.5～2.5之間，此值的高低，代表了機(jī)體細(xì)胞免疫水平。CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞二者中的一方升高或降低，或者出現(xiàn)比值倒置，表明機(jī)體正常的免疫平衡狀態(tài)被打破，細(xì)胞免疫功能被抑制，免疫細(xì)胞的活化和增殖速度減慢，分泌細(xì)胞因子減少，對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷能力也隨之下降，從而增加了腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)體發(fā)生HT時(shí)，在環(huán)境等因素的誘導(dǎo)下，B細(xì)胞受到CD4+T細(xì)胞活化后，被募集至甲狀腺并產(chǎn)生甲狀腺自身抗體，導(dǎo)致該器官的自身免疫性損害。同時(shí)，活化的CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步活化CD8+T細(xì)胞，產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated. cytotoxicity,ADCC)效應(yīng)，使甲狀腺細(xì)胞進(jìn)一步受到損害。因此，HT的發(fā)病機(jī)制有體液免疫和細(xì)胞免疫的共同參與[11]。近年來，PTC并發(fā)HT的病例逐年增多，HT患者相比其他甲狀腺疾病來說，更容易發(fā)生癌變，而癌變后絕大多數(shù)為PTC。有研究發(fā)現(xiàn)HT與PTC之間存在免疫方面的相互聯(lián)系[12-13]。PTC體內(nèi)CD4+T細(xì)胞持續(xù)下降，而CD8+T細(xì)胞持續(xù)增多，CD4+/CD8+比例持續(xù)降低，而在HT體內(nèi)有CD4+T細(xì)胞減少，而CD8+T細(xì)胞增多現(xiàn)象，說明在HT與PTC機(jī)體有相似的免疫狀態(tài)。本研究顯示，HT，PTC，PTC并發(fā)HT三組的CD8+均比NC組升高，CD4+均比NC組降低.CD4+/CD8+均比NC組顯著下降，說明PTC及PTC+HT，HT患者T淋巴細(xì)胞亞群均分化異常，機(jī)體存在免疫功能障礙，尤以PTC為甚。提示甲狀腺癌變與機(jī)體免疫功能異常有關(guān)，HT并發(fā)PTC過程中，免疫因素起著關(guān)鍵作用，其癌變可能由于機(jī)體長(zhǎng)期處于持續(xù)免疫功能異常的環(huán)境而導(dǎo)致。希望能通過檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群，達(dá)到對(duì)PTC風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)和評(píng)估，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+也將作為HT，PTC，PTC并發(fā)HT 患者免疫治療的靶點(diǎn)。