基于新城疫病毒V蛋白鑒別雞群感染與免疫的間接ELISA方法的建立

于得水，謝 鵬，梁健鵬，林秋燕，向 斌，徐成剛，廖 明，任 濤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642）

新城疫（newcastle disease，ND）是一種由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的雞和多種禽類發(fā)病的急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)目前主要通過(guò)疫苗免疫的方式對(duì)該病進(jìn)行防控[1]。

NDV的基因組是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA，可分為6個(gè)基因片段，能夠編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白——NP、P、M、F、HN和L[2-3]。此外，P基因可通過(guò)RNA編輯機(jī)制使其mRNA編碼框移碼，翻譯出另外兩種非結(jié)構(gòu)蛋白V和W[4]。研究表明，P基因轉(zhuǎn)錄的3種mRNA存在一定的比例，編碼P蛋白、V蛋白和W蛋白的mRNA分別約占69%、29%和2%[5]。

結(jié)構(gòu)蛋白是病毒粒子的組成成分，而非結(jié)構(gòu)蛋白是病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的一些輔助性蛋白，并不參與病毒粒子的裝配[6-7]。常規(guī)滅活疫苗的抗原成分是失去感染能力的病毒粒子，無(wú)法利用細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白，而野毒感染后會(huì)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白以促進(jìn)病毒復(fù)制，而非結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒抗原會(huì)進(jìn)一步刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[8-9]?；跍缁钜呙绾鸵岸靖腥厩闆r下V蛋白表達(dá)水平差異引起的V抗體水平差異，本研究選擇通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)NDV非結(jié)構(gòu)蛋白V的抗體應(yīng)答水平差異來(lái)區(qū)分NDV疫苗免疫與野毒感染。另外，由于V蛋白與P蛋白、W蛋白的N-端氨基酸序列相同，而C-端不同[10]，為了對(duì)V蛋白抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)，排除P蛋白抗體的干擾，本研究選擇V蛋白C-端結(jié)構(gòu)域（Vc）作為ELISA包被抗原。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白Vc，以其為抗原建立間接ELISA方法。該方法可以通過(guò)檢測(cè)血清中NDV V蛋白的抗體水平，進(jìn)而區(qū)分NDV疫苗免疫與強(qiáng)毒感染。該方法為NDV血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種新的檢測(cè)手段，具有較好的應(yīng)有前景。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）His標(biāo)簽純化填料購(gòu)自GE公司；IPTG購(gòu)自Genview公司；雞新城疫滅活疫苗（La Sota株）購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司；雞新城疫弱毒疫苗（La Sota株）購(gòu)自廣東永順生物制藥有限公司；ELISA抗原包被液、ELISA終止液和脫脂奶粉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；TMB單組份顯色液購(gòu)自百浩生物科技有限公司。

1.2 質(zhì)粒、毒株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 重組質(zhì)粒pET-32a-Vc、新城疫基因Ⅶd亞型重組病毒株rGM（強(qiáng)毒株）和新城疫基因Ⅶd亞型致弱重組病毒株rGM-Ⅶm（疫苗株）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞購(gòu)自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司。

1.3 重組蛋白Vc的原核表達(dá)及目的蛋白的純化 本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-32a-Vc經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后再加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。隨后，使用SDSPAGE和Western blot方法對(duì)重組蛋白rVc進(jìn)行可溶性分析與鑒定。再使用鎳離子親和層析法和蛋白膠切膠回收法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。

1.4 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的確定進(jìn)行方陣滴定試驗(yàn)，具體操作為：取96孔酶標(biāo)板，橫排抗原包被濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 μg/mL，按100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃靜置過(guò)夜，PBST洗板5次；每孔加含7.5%脫脂奶粉的PBS，37℃封閉2 h，PBST洗板5次；豎排陰、陽(yáng)性血清樣品按1∶25、1∶50、1∶100和1∶200稀釋，37℃作用1 h，PBST洗板5次；加入1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，37℃作用1 h，PBST洗板5次；加入TMB單組份顯色液，室溫作用10 min后，加入ELISA終止液終止反應(yīng)。

1.5 間接ELISA方法陰、陽(yáng)性臨界值的確定 用上述建立好的ELISA方法對(duì)60份NDV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，樣品D450≥+3SD時(shí)判定為陽(yáng)性，D450≤+2SD時(shí)判定為陰性，介于兩者之間時(shí)為可疑值。

1.6 間接ELISA方法特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 使用上述建立好的ELISA方法，檢測(cè)H7N9與H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、K亞群禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALVs）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）和禽腺病毒4型（Adenovirus，F(xiàn)AdV-4）陽(yáng)性血清，以驗(yàn)證本方法是否與其他禽源病毒血清存在交叉反應(yīng)。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及V蛋白抗體的檢測(cè) 設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，具體方案見(jiàn)表1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采集的血清樣品進(jìn)行HI抗體檢測(cè)，確定免疫成功后，再使用上述建立好的ELISA方法進(jìn)行V蛋白抗體檢測(cè)。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案Table 1 Animal experiment program

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：包被1次酶標(biāo)板，按照上述建立好的ELISA方法，對(duì)4份陽(yáng)性血清和4份陰性血清進(jìn)行1次重復(fù)性檢測(cè)，每份樣品做3個(gè)重復(fù)，然后根據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算變異系數(shù)；板間重復(fù)性試驗(yàn)：分別包被3次酶標(biāo)板，對(duì)4份陽(yáng)性血清和4份陰性血清進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rVc的原核表達(dá)及純化 重組質(zhì)粒pET-32a-Vc轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行原核表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白Vc存在于上清中，為可溶性蛋白。先使用鎳離子親和層析法對(duì)目的蛋白Vc進(jìn)行純化，純化后的目的蛋白中含有少量雜蛋白，為了避免這些雜蛋白干擾后續(xù)ELISA方法的特異性，再使用PAGE膠蛋白回收法進(jìn)行純化。再次純化后的目的蛋白中無(wú)明顯的雜蛋白條帶，見(jiàn)圖1。

2.2 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的確定 方陣滴定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，當(dāng)抗原包被濃度為1.6 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶50時(shí)，ELISA反應(yīng)后的陽(yáng)性血清D450均值在1.0左右，且此時(shí)P/N值最大，即確定為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)。

2.3 間接ELISA方法陰、陽(yáng)性臨界值的確定 60份陰性血清檢測(cè)結(jié)果的平均值（）為0.164，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.043，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算：樣品D450≥+3SD（即0.29）時(shí)判定為陽(yáng)性，D450≤+2SD（即0.25）時(shí)判定為陰性，介于兩者之間時(shí)為可疑值。另外，為了降低環(huán)境因素和人為因素等差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，計(jì)算中引入S/P值對(duì)該ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正。

2.4 間接ELISA方法特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 使用上述建立好的ELISA方法檢測(cè)AIV、ALV-K、IBV、IBDV和FAdV-4陽(yáng)性血清。檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性良好，與其他常見(jiàn)禽源病毒血清無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清HI抗體和V蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)全部血清樣品進(jìn)行HI抗體檢測(cè)。結(jié)果表明：rGM-Ⅶm滅活疫苗組、La Sota滅活疫苗組、rGM-Ⅶm弱毒疫苗組和La Sota弱毒疫苗組均免疫成功，免疫3周后的HI抗體平均效價(jià)分別為10.1log2、8.3log2、8.3log2和7.6 log2；PBS組均為0log2；NDV強(qiáng)毒rGM株攻擊后1周內(nèi)，雞全部死亡，故未按計(jì)劃采集血清進(jìn)行檢測(cè)。采用上述建立好的ELISA方法對(duì)血清樣品中的V蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。結(jié)果顯示：PBS組和2組滅活疫苗組免疫后的3周內(nèi)，V蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性；兩組滅活疫苗組免疫3周后，人工感染NDV強(qiáng)毒rGM株，攻毒后第7、14和21 d的V蛋白抗體陽(yáng)性率分別為60%、80%、70%和50%、80%、70%，經(jīng)計(jì)算，其S/P均值都＞0.29，因此，這兩組可判定為陽(yáng)性；兩組弱毒疫苗組免疫后的3周內(nèi)，第7 d和14 d的V蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，僅在第21 d分別檢測(cè)出20%和10%的血清樣品呈V蛋白抗體陽(yáng)性，但經(jīng)計(jì)算，其S/P均值都＜0.25，因此從群體水平上看，這兩組也可判定為陰性。

圖1 重組蛋白rVc原核表達(dá)及純化后的SDS-PAGE(A)與Western blot(B)結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) results of prokaryotic expression and purification of rVc

表2 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的確定Table 2 Determination of optimal antigen coating concentration and optimal serum dilution factor

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 采用上述建立好的ELISA方法，對(duì)4份陽(yáng)性血清和4份陰性血清進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和板間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%，表明該方法重復(fù)性較好。

3 討論

區(qū)分動(dòng)物的免疫與感染（differentiation of infected from vaccinated animals，DIVA）是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物病毒性疫病凈化的重要手段[8,11-12]?！秶?guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃》要求在2020年實(shí)現(xiàn)對(duì)種雞場(chǎng)完成新城疫的凈化，而疫病的凈化要求在一定范圍內(nèi)清除病原體并保持無(wú)疫病狀態(tài)，全面應(yīng)用滅活疫苗，禁用活疫苗是實(shí)現(xiàn)疫病進(jìn)化的重要前提。但是目前我國(guó)所使用的血清學(xué)診斷方法無(wú)法有效的鑒別NDV疫苗與野毒感染，需要建立一種新的方法。本研究從NDV復(fù)制的機(jī)制出發(fā)，基于非結(jié)構(gòu)蛋白V僅在復(fù)制過(guò)程中大量產(chǎn)生這一現(xiàn)象，擬通過(guò)建立一種V蛋白抗體定量的ELISA方法，評(píng)估動(dòng)物的感染狀態(tài)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滅活疫苗免疫后，ELISA檢測(cè)結(jié)果為陰性，而野毒感染株陽(yáng)性率在50%以上，存在顯著差異，因此可以使用該方法對(duì)雞群的免疫和感染狀態(tài)進(jìn)行有效的鑒別。同時(shí)，本研究也對(duì)弱毒株感染后的V蛋白抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明其陽(yáng)性率不高于20%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于強(qiáng)毒感染后的陽(yáng)性率，該試驗(yàn)結(jié)果也為弱毒免疫和強(qiáng)毒感染的鑒別提供了新的方法，有助于禽場(chǎng)把握禽群感染情況并采取相應(yīng)措施。此外，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，盡管雞群免疫后會(huì)產(chǎn)生較高的HI抗體水平，可以保護(hù)雞群不死亡甚至不發(fā)病，卻無(wú)法徹底阻擋強(qiáng)毒的感染和復(fù)制，可能是導(dǎo)致免疫雞群存在長(zhǎng)期帶毒的原因。

圖2 免疫后的V蛋白抗體水平Fig.2 V protein antibody levels after immunization

圖3 滅活疫苗免疫3周再攻強(qiáng)毒后的V蛋白抗體水平Fig.3 V protein antibody levels after inactivated vaccine immunization for 3 weeks

目前我國(guó)流行的NDV強(qiáng)毒以基因Ⅶ型為主，本研究中表達(dá)的重組蛋白Vc來(lái)源于基因Ⅶ型GM株，將其氨基酸序列與其他基因Ⅶ型NDV毒株（AF431744、AF473851、AY562985、AY865652、DQ83939、DQ485229、DQ485230、DQ659677和EU167540）的同源性為78.8%～97.1%，差異不大，與已有報(bào)道相符[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，V蛋白抗體與不同毒株的抗原均具有較好的反應(yīng)性[14]，因此該檢測(cè)方法能夠?qū)DV基因Ⅶ型不同的毒株進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的通用性。

綜上，本文建立了一種新的ELISA 檢測(cè)方法，可用于監(jiān)測(cè)免疫禽群的NDV感染情況，特別是能夠有效地鑒別滅活疫苗免疫和野毒感染，其應(yīng)用有望于幫助養(yǎng)禽廠逐步實(shí)現(xiàn)新城疫的凈化。