犬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法的建立

熊 煒，薛俊欣，王楷宬，蔣 靜，黃保續(xù)，田楨干，林穎崢，李 健

（1.上海市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，上海200135；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島266032）

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一種急性傳染病，臨床上以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征[1-2]。CPV主要通過(guò)直接或間接接觸感染，多發(fā)于3～6月幼齡犬，感染率可高達(dá)100%，致死率為10%～50%[3]。該病的流行無(wú)明顯季節(jié)性，感染犬是本病的主要傳染源，犬群一旦發(fā)病，極難徹底清除，除犬外，貓、狼、狐、浣熊也可自然感染[4-7]。CPV隨糞便、尿液、嘔吐物及唾液排出體外，康復(fù)犬糞便中可長(zhǎng)期帶毒[8-9]。已有的診斷方法中，病毒分離、血凝抑制、電鏡檢查、ELISA等方法操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不利于實(shí)現(xiàn)快速診斷；膠體金檢測(cè)方法盡管可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，但是確診往往需要通過(guò)更為靈敏和準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法；分子生物學(xué)方法中，PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR需要特定的擴(kuò)增儀器，不便于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢疫；盡管環(huán)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但是由于其特異性方面的缺陷容易導(dǎo)致誤診[10-14]。最近的研究表明，重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種新型的、可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，它能夠在20 min內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合野外及檢疫現(xiàn)場(chǎng)使用。為了提高口岸對(duì)進(jìn)出境野生及家養(yǎng)犬貓科動(dòng)物CPV感染情況監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查的效率，本研究建立了CPV實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DNA抽提試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kits）購(gòu)自QIAGEN公司，Taq酶、dNTP、DL2000 DNA marker、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司；RPA檢測(cè)試劑購(gòu)自TwistDx Inc公司；磷酸鹽緩沖液（pH7.4）購(gòu)自Gibico公司；其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 病毒樣品來(lái)源及處理 CPV、陽(yáng)性核酸和組織病料來(lái)自于上?？诎兜娜刖硨櫸锛吧虾５貐^(qū)寵物醫(yī)院的病犬，組織病料包括病犬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官及血液、尿、糞便等體液樣本。本研究使用的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）、犬冠狀病毒（Canine coronavirus，CCV）、犬傳染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、牛細(xì)小病毒（Bovine parvovirus，BPV）、小鼠細(xì)小病毒（Minute virus of mice，MVM）等由本實(shí)驗(yàn)室保存。將待檢組織樣品加等體積磷酸鹽緩沖液研磨勻漿，3000×g離心15 min后，收集上清液待檢。

1.3 核酸提取及cDNA模板制備 對(duì)于DNA病毒樣品，取100 μL組織上清液或體液樣本，按DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行病毒DNA提取，最后將DNA用50 μL水溶解，即得PCR模板；對(duì)于RNA病毒樣品，取100 μL上清液或體液，用TRIzol方法提取RNA，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA模板。

1.4 PCR檢測(cè) 針對(duì)CPV的衣殼蛋白（VP2）基因設(shè)計(jì)引物[15]，擴(kuò)增基因片段大小為441 bp，其上游引物（CPVF）序列為：5'-ATCACAGCAAACTCAAGC AGAC-3'，下游引物（CPVR）序列為：5'-TGGA GTTGGTATGGTTGGTTTC-3'。反應(yīng)體系：DNA模板1 μL、10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光RPA引物和探針 使用Vector NTI Suite軟件分析不同國(guó)家和地區(qū)分離的CPV的VP2基因保守序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)RPA引物和探針。實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)的上游引物（RPAY-CPVF）為：5'-ACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAG AGA-3'，下游引物（RPAY-CPVR）為：5'-AGCA ATACATTATCATCTGTTACAGGAAGG-3'，RPA探針（RPAY-CPVP）為：TACATATAT AGCACATCAAGATACAGGAAGA（FAM-dt）（THF）（BHQ1-dt）CAGAAGGAGA-C3。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.6 實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè) 反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)緩沖液25 μL、dNTP 7.2 μL、10×探針酶混合物5 μL、上下游引物（RPAY-CPVF、RPAY-CPVR）各2.1 μL、10 μmol/L熒光探針0.6 μL，混勻后，再加入20×核心反應(yīng)液2.5 μL、50×RT反應(yīng)液1 μL、50×Exo反應(yīng)液1 μL；混勻后，加入280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL、待檢核酸溶液1 μL。39℃孵育25 min。反應(yīng)結(jié)束后，查看熒光擴(kuò)增曲線并進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV的特異性試驗(yàn) 分析CPV的VP2基因序列，設(shè)計(jì)引物及探針，建立實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV方法，并利用本方法分別檢測(cè)其他犬病毒（CDV、CCV、ICHV、CPIV）和其他種屬的細(xì)小病毒（PPV、BPV、MVM），同時(shí)與普通PCR方法進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)所建立方法的特異性。結(jié)果顯示：實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)時(shí)，CPV陽(yáng)性樣品在反應(yīng)5 min后熒光信號(hào)出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，其他犬病毒和其他種屬的細(xì)小病毒均未檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖1A）；普通PCR檢測(cè)時(shí)，CPV陽(yáng)性樣品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他對(duì)照病毒均呈陰性結(jié)果（圖1B）。

圖1 實(shí)時(shí)熒光RPA(A)和PCR(B)檢測(cè)CPV的特異性Fig.1 The specificity analysis of real-time fluorescence RPA(A)and PCR(B) in CPV detection

2.2 實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV的敏感性試驗(yàn) 為檢測(cè)建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法的敏感性，將CPV陽(yáng)性樣品DNA進(jìn)行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再分別用實(shí)時(shí)熒光RPA和PCR方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，該研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA與PCR檢測(cè)樣品CPV陽(yáng)性DNA模板的下限量為1～10 pg（圖2）

圖2 實(shí)時(shí)熒光RPA(A)和PCR(B)檢測(cè)CPV的敏感性Fig.2 The sensitivity of real-time fluorescence RPA(A) and PCR(B) in CPV detection

2.3 實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV的重復(fù)性試驗(yàn) 為了檢測(cè)建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法的重復(fù)性，將實(shí)時(shí)熒光RPA方法用于病死犬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等不同的組織器官及血液、尿、糞便等樣本的CPV檢測(cè)，另有36份CPV陰性犬糞便樣品同樣進(jìn)行檢測(cè)，并且所有樣品同時(shí)用PCR方法復(fù)檢。結(jié)果顯示，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV陽(yáng)性犬的4份組織樣品和血液、尿液、糞便均呈顯著熒光信號(hào)擴(kuò)增，而空白對(duì)照和所有CPV陰性樣品均未檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3A），PCR復(fù)檢結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%（圖3B）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光RPA（A）和PCR（B）檢測(cè)CPV陽(yáng)性犬的不同組織及液體樣品Fig.3 Detection of different tissues and liquid samples of CPV positive dogs with real-time fluorescence RPA (A) and PCR(B)

2.4 實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)CPV分離株 用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室不同時(shí)期分離的7株CPV野毒株。結(jié)果顯示，7株CPV經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)均出現(xiàn)了熒光信號(hào)的顯著擴(kuò)增，而空白對(duì)照未檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖4A）；這7株CPV經(jīng)PCR檢測(cè)均擴(kuò)增出了目的大小的基因片段（圖4B）。

3 討論

利用實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CPV準(zhǔn)確靈敏的診斷。CPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，其基因組為單鏈DNA，該病毒屬中還包括人細(xì)小病毒B19、PPV、BPV、MVM以及貓細(xì)小病毒等[16-17]。本研究建立的檢測(cè)CPV實(shí)時(shí)熒光RPA方法具有良好的特異性，與CPV同步檢測(cè)的其他犬病毒（如：CDV、CCV、ICHV、CPIV）以及其他動(dòng)物的細(xì)小病毒（如：PPV、BPV、MVM）均未出現(xiàn)RPA熒光信號(hào)的增強(qiáng)。通過(guò)與國(guó)標(biāo)中提供的PCR檢測(cè)方法的比對(duì)，證實(shí)本研究建立的檢測(cè)CPV實(shí)時(shí)熒光RPA方法具有與PCR方法一致的特異性和敏感性。通過(guò)對(duì)不同CPV陽(yáng)性組織、體液樣本和36份CPV陰性樣品以及CPV分離株的檢測(cè)和驗(yàn)證，證實(shí)本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法具有與標(biāo)準(zhǔn)PCR方法一致的穩(wěn)定性和可靠性。

圖4 實(shí)時(shí)熒光RPA（A）和PCR（B）檢測(cè)7種CPV野毒株Fig.4 Detection of 7 CPV wild strains by real-time fluorescence RPA (A)and PCR(B)

實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法具有眾多優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)PCR方法相比，其檢測(cè)周期極短（包括結(jié)果判讀在內(nèi)，僅需10～20 min）、操作簡(jiǎn)單（只需將核酸與檢測(cè)體系混合放于恒溫設(shè)備中即可，RNA檢測(cè)不需逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程）、檢測(cè)設(shè)備便攜（筆記本大小，充電一次可運(yùn)行12 h）、結(jié)果判定簡(jiǎn)便直觀，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)及野外使用[18]。

由于犬細(xì)小病毒病是一種高度接觸性烈性傳染病，其發(fā)病快、致死率高，因此做好CPV的預(yù)防免疫，早診斷、早隔離是控制CPV傳播的主要途徑[19-20]。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法豐富了現(xiàn)有的CPV核酸檢測(cè)和診斷體系，其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)特別適合在野外監(jiān)測(cè)點(diǎn)、犬科動(dòng)物繁育場(chǎng)和一線獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室推廣使用，這對(duì)提高檢疫效率、控制CPV傳播、保護(hù)犬科動(dòng)物健康和減少養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。