一株類NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒的全基因組序列分析

李天宇，常亞飛，阮坤祥，王同燕，譚菲菲，李向東，田克恭

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 410005；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽 471003；3.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽 471000）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以母豬嚴(yán)重流產(chǎn)和各年齡段豬呼吸障礙為特征的重要的病毒性傳染病。PRRS在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

PRRSV是一種單股正鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，有囊膜，其基因組包括至少10個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）：ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，其中ORF1a和ORF1ab編碼病毒為非結(jié)構(gòu)蛋白，其它ORF編碼病毒為結(jié)構(gòu)蛋白[2]。PRRSV主要分為兩個(gè)基因型：以Lelystad virus（LV）為代表的基因1型（歐洲型）和以VR2332為代表的基因2型（美洲型）[3]。1996年，我國首次分離到PRRSV，并將其命名為CH-1a毒株[4]；2006年，高致病性PRRS（highly pathogenic PRRS，HPPRRS）在我國流行其病原體被命名為高致性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）[5]；2013年，周峰等[6]首次分離到一株類PRRSV毒株，該毒株在NSP2基因區(qū)存在131（111+1+19）個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。以HENAN-XINX和HENAN-HEB為代表，與2008年美國分離到的NADC30毒株類似，因此將該類毒株命名為類NADC30。之后，類NADC30型PRRSV逐步在我國流行[7-8]。

本研究從臨床樣品分離獲得一株類NADC30 PRRSV，命名為180404-2fei，對(duì)其NSP2基因、ORF5基因以及全基因組序列進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)全基因進(jìn)行了重組分析。

1 材料與方法

1.1 病料及處理 采集某豬場(chǎng)疑似患有PRRS發(fā)病豬的肺臟，剪碎、研磨，提取病毒基因組。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑、dNTP購自Promega公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；2×TaqPCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸出液購自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要設(shè)備 Mini臺(tái)式離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；PCR儀購自ABI公司；紫外透射分析儀購自其林貝爾公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自美國Hoefer公司；紫外成像儀購自美國UVP公司；恒溫培養(yǎng)箱購自德國MMM公司；空氣浴震蕩搖床購自美國NBS公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PRRSV美洲型毒株VR-2332（GenBank登錄號(hào)：U87392）和NADC30（GenBank登錄號(hào)：JN654459）全基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)12對(duì)引物，所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.5 樣品的全基因獲取 將研磨液在4℃ 10 800×g條件下離心10 min，取上清，按照核酸提取試劑盒Viral Nucleic Acid Extraction Kit的操作說明提取核酸，按照M-MLV Reverse Transciptase的操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PRRSV鑒定和分型引物，按照2×TaqPCR MasterMix說明對(duì)上述cDNA進(jìn)行鑒定和分型。使用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase對(duì)類NADC30 PRRSV分12段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL，10 pmol/L上、下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 31.5 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 kb/min，共33個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min?；厥漳康钠?，克隆至pEASY-Blunt載體，陽性克隆送金唯智生物科技公司測(cè)序。利用DNAStar對(duì)測(cè)序的各片段序列進(jìn)行拼接，最終獲得全基因序列。

表1 擴(kuò)增全基因組序列引物Table 1 Primers used for amplification of full genome

1.6 同源性和遺傳進(jìn)化分析 利用DNAStar軟件中的MegAlign對(duì)180404-2fei與參考毒株（表2）的NSP2基因和ORF5基因進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析。使用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighborjoining；bootstrap values of 1000 replicates；Kimura two-parameter）對(duì)180404-2fei與參考毒株（表2）的NSP2基因、ORF5基因及全基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.7 重組分析 利用SimPlot軟件將180404-2fei與各種類型毒株的代表VR2332、09HEN1和NADC30進(jìn)行重組分析，繪制重組分析圖。

2 結(jié)果

2.1 樣品的全基因獲取結(jié)果 利用DNAStar軟件對(duì)獲得的NSP2氨基酸全序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，180404-2fei毒株的NSP2基因在322～432位（圖1A）、483位（圖1B）及504～522位（圖1C）共缺失131（111+1+19）個(gè)氨基酸，與2008年美國分離到的NADC30毒株和我國分離到的類NADC30毒株具有相似的缺失特征（圖1）。以上結(jié)果表明，此毒株屬于類NADC30 PRRSV。

2.2 NSP2基因同源性分析結(jié)果 利用DNAStar軟件中MegAlign將180404-2fei毒株的NSP2基因核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列與參考序列（表2）比對(duì)。結(jié)果顯示：180404-2fei毒株的NSP2基因與歐洲型代表株LV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為53.6%和34.9%；與HP-PRRSV代表株JXA1毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為74.7%和68.9%；與經(jīng)典型代表株P(guān)RRSV VR2332和CH-1a毒株的核苷酸序列同源性分別為77.3%和75.1%，氨基酸序列同源性分別為72.5%和70.4%；與NADC30毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為92.2%和90.1%。180404-2fei NSP2基因的核苷酸和氨基酸序列與NADC30同源性最高。

表2 參考毒株信息Table 2 The information of reference strains

2.3 NSP2基因遺傳進(jìn)化分析 目前PRRSV分為歐洲型和美洲型，其中美洲型又分為5個(gè)亞群，即以NADC30為代表的NADC30-Like亞群、以VR2332為代表的VR2332-Like亞群、以CH-1a為代表的CH-1a-Like亞群、以QYYZ為代表的QYYZ-Like亞群及以JXA1為代表的HP-PRRSV-Like亞群。將180404-2fei毒株與參考毒株（表2）的NSP2基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），NSP2基因的遺傳演化分析結(jié)果表明，180404-2fei毒株屬于NADC30-Like亞群。

2.4 ORF5的同源性分析 利用DNAStar軟件中MegAlign將180404-2fei毒株的ORF5基因核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列與參考序列（表2）比對(duì)。結(jié)果顯示，其與歐洲型LV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為62.1%和53.2%；與VR2332和CH-1a的核苷酸序列同源性分別為85.1%和85.7%，氨基酸序列同源性分別為82.1%和84.6%；與JXA1的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為84.1%和83.6%；與NADC30的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為93.5%和92.0%。180404-2fei ORF5基因的核苷酸和氨基酸序列與NADC30同源性最高。

2.5 ORF5基因序列的遺傳進(jìn)化分析 將180404-2fei毒株與參考毒株（表2）的ORF5基因序列比對(duì)，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。ORF5基因的遺傳演化分析結(jié)果表明，180404-2fei毒株屬于NADC30-Like亞群（圖3）。

2.6 全基因遺傳演化分析 將180404-2fei毒株與參考毒株（表2）的全基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，180404-2fei毒株與以VR2332和CH-1a為代表的經(jīng)典型毒株和以JXA1為代表的HP-PRRSV毒株同屬于美洲型（2型），但屬于不同的亞群；其與NADC30、HNyc15、HENANXINX同屬于一個(gè)亞群。全基因的遺傳演化分析結(jié)果表明，180404-2fei毒株屬于NADC30-Like亞群（圖4）。

2.7 重組分析 利用SimPlot軟件將180404-2fei與參考毒株VR2332、09HEN1和NADC30進(jìn)行重組分析。結(jié)果顯示，180404-2fei與HP-PRRSV存在重組，重組區(qū)域?yàn)?439～8035（圖5）。表明180404-2fei毒株是一個(gè)以NADC30毒株為母本，同時(shí)由HP-PRRSV毒株提供重組片段的重組病毒。

圖1 NSP2基因的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.1 Comparison of amino acid sequences of NSP2 gene

圖2 基于NSP2基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of NSP2 gene

圖 3 基于 ORF5 基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析Fig .3 Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of ORF5 gene

圖5 PRRSV 180404-2fei毒株的重組分析Fig. 5 Recombination analysis of PRRSV strain 180404-2fei

3 討論

PRRS是世界養(yǎng)豬業(yè)中的重大傳染病之一。1996年，我國首次報(bào)道分離到PRRSV。2006年，我國南方廣泛流行HP-PRRS，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。2008年，美國學(xué)者分離到一株P(guān)RRSV，并將其命名為NADC30，其特征是在NSP2區(qū)存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。2013年，周峰等[6]在我國分離到在NSP2區(qū)與NADC30毒株具有相同缺失特征的毒株，稱之為類NADC30。隨后，類NADC30 PRRS在全國各地廣泛流行。近幾年，本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)類NADC30毒株進(jìn)行了持續(xù)跟蹤研究[9-13]。

了解病毒基因組結(jié)構(gòu)的重要途徑是全基因序列測(cè)定與分析。PRRSV基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的NSP2基因變異最大，主要表現(xiàn)在堿基的缺失、置換和插入上，可以作為檢測(cè)PRRSV變異的標(biāo)記基因。通過對(duì)180404-2fei毒株的NSP2基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析、遺傳進(jìn)化分析，證實(shí)了該毒株在NSP2區(qū)有不連續(xù)的131（111+1+19）個(gè)氨基酸缺失，屬于類NADC30 PRRSV。

PRRSV基因組中編碼結(jié)構(gòu)蛋白的ORF5基因變異很大，ORF5基因編碼的GP5蛋白為PRRSV的免疫原性蛋白，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，在引起特異性細(xì)胞免疫方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ORF5基因是分析PRRSV多樣性的靶基因。通過對(duì)180404-2fei毒株的ORF5基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列與NADC30毒株遺傳距離較近，同處一個(gè)亞群，而與VR2332毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。

PRRSV是單股正鏈RNA病毒，為適應(yīng)環(huán)境，易發(fā)生重組。大量研究表明，類NADC30 PRRSV容易發(fā)生重組，如類JL580和FJ1402毒株是由NADC30 PRRSV和HP-PRRSV重組而成[7,14]。本研究對(duì)180404-2fei毒株進(jìn)行重組分析發(fā)現(xiàn)180404-2fei與HP-PRRSV存在重組，進(jìn)一步證實(shí)了類NADC30 PRRSV的重組現(xiàn)象。

本研究基于獲得的180404-2fei全基因序列，對(duì)NSP2基因和ORF5基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，對(duì)該毒株NSP2基因、ORF5基因進(jìn)行遺傳演化分析，并對(duì)該毒株進(jìn)行全基因重組分析，最終確定180404-2fei屬于類NADC30 PRRSV，并與HP-PRRSV存在重組。本研究豐富了類NADC30毒株的基因組信息，同時(shí)為該類毒株的防控提供了數(shù)據(jù)支持。