2017～2018年華中地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)分析

鄧文芳，宋文博，胡星星，賈 雙，陳翔鴻，喻紅艷，湯細(xì)彪

（武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），其核酸是一種單股、閉合、環(huán)狀DNA分子，基因組大小約為1766 bp[1]。PCV2自1998年首次被發(fā)現(xiàn)后就一直受到世界的關(guān)注，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（posting-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原之一，可在淋巴系統(tǒng)內(nèi)增殖引起機體免疫抑制，導(dǎo)致免疫力下降，并引起其他病原的繼發(fā)感染[2-3]。此外PCV2常與豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory sydrome，PRRSV）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）混合感染。

PCV2的ORF2基因主要編碼衣殼蛋白（Cap蛋白），為PCV2主要免疫原性蛋白。根據(jù)PCV2 ORF2基因序列的差異，PCV2可以分為2a、2b、2c、2d、2e等基因亞型。前期研究表明，PCV2b為我國流行的主要基因亞型，具有致病性；國外學(xué)者通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)PCV2流行的主要基因亞型有從PCV2b向PCV2d轉(zhuǎn)變的趨勢[4-7]。2016年，Xiao等[8]報道，美國PCV2d感染率從2012年37.8%上升到2017年72.0%，說明PCV2d已替代PCV2b成為主要的流行毒株。本實驗采集華中地區(qū)3個省份疑似PCV2感染的樣品進行檢測，對其中38份陽性樣品進行ORF2基因克隆和測序，并進行同源性分析和遺傳進化分析，初步掌握了2017～2018年我國PCV2的分子流行趨勢，為PCV2的臨床防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 2017～2018年間共采集華中地區(qū)（湖北、湖南、河南）1592份疑似PCV2感染的組織樣品，包括肺臟、腎臟、淋巴結(jié)和脾臟等，放入-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pMD19-T載體和DL1000 DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 病毒DNA的提取 將組織樣品剪碎后，加入500 μL PBS稀釋，經(jīng)全自動組織研磨機混合研磨制成勻漿，-80℃反復(fù)凍融3次，6000×g離心10 min，取上清液。按照病毒核酸提取試劑盒說明書操作步驟提取病毒DNA，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的PCV2序列（GenBank登錄號：AY424401.1）設(shè)計引物，見表1。F1/B1為樣品PCV2檢測引物，目的片段為496 bp；F2/B2為ORF2基因序列克隆引物，目的片段為958 bp，引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 本研究引物Table1 Primers used in this study

1.5 樣品的PCR檢測 以提取的病毒DNA為模板，以F1/B1為引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系（20 μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 10 μL，F(xiàn)1、B1各1 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察檢測結(jié)果。

1.6 ORF2基因的克隆及測序 在鑒定為PCV2陽性的部分樣品中，按月份隨機選取條帶較亮樣品的病毒DNA，用基因克隆引物F2/B2進行ORF2基因序列擴增，反應(yīng)體系（20 μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 10 μL，F(xiàn)2、B2各1 μL，ddH2O 5 μL，DNA模板3μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火40 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察檢測結(jié)果。將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化，選取單個菌落，接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、300r/min振蕩培養(yǎng)12 h，使用F2/B2引物進行菌液PCR鑒定。對鑒定為陽性的菌液進行質(zhì)粒提取，送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.7 序列的比對與分析 用DNAStar軟件將測序得到的ORF2基因序列與GenBank中已公布的22條參考序列（表2）進行同源性分析和氨基酸多序列比對，采用MEGA 6軟件繪制分子遺傳進化樹。

表2 本實驗使用的22株P(guān)CV2參考序列Table2 The PCV2 reference sequences used in this study

2 結(jié)果

2.1 樣品的PCR檢測結(jié)果 運用PCV2檢測引物F1/B1對樣品進行PCR擴增，陽性樣品能夠擴增出大小為496 bp的特異性條帶（圖1）。樣品PCR檢測的結(jié)果顯示：在2017～2018年采集的1592份病料中，1091份樣品為PCV2陽性，陽性率為68.53%，湖北、河南和湖南3個省份豬群PCV2感染陽性率分別為68.90%、67.20%、70.70%，表明PCV2在華中地區(qū)豬群中感染較為普遍，見表3。

表3 華中地區(qū)三省份豬群PCV2感染情況Table 3 PCV2 infection in three provinces of central China

2.2 PCV2 ORF2基因的克隆 在PCV2鑒定陽性樣品中按月份隨機選取PCR鑒定條帶較亮的38份樣品（表4）進行PCV2 ORF2基因序列的克隆。利用引物F2/B2進行PCR擴增，可獲得大小約為958 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 部分陽性樣品PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Some positive samples were identified by PCR

2.3 PCV2 ORF2基因同源性分析 將陽性PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體后進行測序，測序結(jié)果與22株參考序列進行同源性比對。結(jié)果顯示：本研究獲得的38株P(guān)CV2 ORF2序列之間的同源性為89.5%～100%，與22株參考序列的同源性為81.1%～99.9%，其中大部分序列與PCV2d亞型的參考序列KJ680369同源性最高，可達99.9%，部分毒株同源性對比結(jié)果見圖3。

表4 38株P(guān)CV2序列的來源和命名Table 4 Source and name of 38 PCV2 strains

圖2 部分陽性樣品ORF2基因序列的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR results of partial ORF2 gene sequences

2.4 ORF2基因遺傳進化分析 將38株P(guān)CV2 ORF2基因序列與22株參考序列進行遺傳進化分析。結(jié)果顯示，所獲得的38株序列分布于PCV2a、PCV2b、PCV2d 3個分支，其中33株（湖北16株、河南12株、湖南5株）屬于PCV2d基因型，占分離株的86.2%；4株（湖北2株、河南1株、湖南1株）屬于PCV2b基因型；1株（湖北1株）屬于PCV2a基因型，未發(fā)現(xiàn)2c和2e基因型，證明2017～2018年華中地區(qū)PCV2流行毒株以PCV2d基因型為主（圖4）。

2.5 ORF2基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 將38株ORF2基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行多序列比對和同源性分析，各氨基酸序列之間同源性為89.4%～100%，與22株參考氨基酸序列同源性為94.4%～100%。以AF055394為參考序列對38株ORF2基因推導(dǎo)氨基酸序列進行多序列比對，從圖5中可以看出，主要變異位點為53～91、121～151、190～210 aa。另外也存在一些散在的突變位點，如8、30、170、185、205 aa等。I53、K59、R63、N68、T90、L89、T121、N134、R/G169、D210、I215均為PCV2d區(qū)別于PCV2b的氨基酸變異位點。另外，如圖5中方框位置為文獻報道的Cap蛋白表位[9]，其中部分毒株的氨基酸序列發(fā)生了變異，這可能和不同毒株之間的毒力差異相關(guān)。

圖3 部分毒株ORF2基因同源性對比Fig.3 Homology analysis of ORF2 gene of partial strains

圖4 PCV2 ORF2基因遺傳進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PCV2 ORF2 gene

3 討論

近年來，我國動物病原流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示，PCV2的感染率有明顯的上升趨勢[10-11]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，如何做好PCV2的防控工作成為當(dāng)前的一大難題。本研究顯示2017～2018年華中地區(qū)PCV2的陽性率為68.53%（1091/1592），與2010～2013年四川省PCV2的陽性率（70.7%）接近[3]，然而相較于2008～2011年全國12個省市PCV2的陽性率（78.3%）較低[10]，可能是由于本文的樣品檢測數(shù)目（1592份）遠高于前者（452份），且不同地區(qū)PCV2感染率有差異。

根據(jù)PCV2近年來的分子流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，PCV2d基因型已成為我國流行的優(yōu)勢基因型。徐朋麗等[12]在河南省分離出的21株P(guān)CV2中，16株屬于PCV2d，5株屬于PCV2b基因型。本研究中38株P(guān)CV2 ORF2基因序列同源性為89.5%～100%，說明華中地區(qū)流行的PCV2分子間有差異。同時將38株P(guān)CV2 ORF2基因序列與22株參考毒株基因序列進行遺傳進化樹分析，進化樹顯示38株序列分屬于PCV2a、PCV2b、PCV2d 3個分支，其中PCV2d基因型有33株，說明華中地區(qū)以PCV2d為流行基因型。

圖5 PCV2 ORF2推導(dǎo)氨基酸序列比對Fig.5 Multiple sequence alignment of amino acid of Cap protein

PCV2的ORF2基因主要編碼Cap蛋白，本研究通過比對38株ORF2基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列和PCV2b Cap蛋白氨基酸參考序列（GenBank登錄號：AAC35331.1）可知，Cap蛋白氨基酸序列在多個區(qū)域存在較高的變異，主要變異位點為53～91、121～151、190～210 aa，與國內(nèi)外多名學(xué)者研究結(jié)果一致[13-14]。另外，Cap蛋白表面存在的潛在表位在免疫壓力下易發(fā)生突變，從而改變病毒的毒力和致病性[9]，本研究中在這些蛋白表位區(qū)域，不同的毒株序列存在突變，這可能會導(dǎo)致不同毒株之間的差異，給臨床PCV2的防控帶來一定的難度。目前接種疫苗是PCV2感染的主要防控手段，市場上商品化疫苗以PCV2a和PCV2b基因型為主，但PCV2a和PCV2b基因型疫苗對PCV2d基因型的免疫效果還需進一步研究分析[15]。

本研究初步掌握了2017～2018年華中地區(qū)PCV2的流行動態(tài)，并對ORF2基因特征進行了初步分析，為臨床PCV2的防控提供了一定的指導(dǎo)，也為PCV2d疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。