flaA基因的缺失對綿羊腦炎單核細胞增生李斯特菌的細胞黏附、侵襲能力及生物被膜形成能力影響的研究

柴迎錦 ，孔靜雅 ，鄔 琴 ，李 劼 ，周 霞 ，馬 勛 ，韓猛立

（1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，石河子 832000）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是人畜共患病的重要病原之一。人感染后有較高的死亡率，在獸醫(yī)臨床中牛羊感染后表現(xiàn)為 “轉(zhuǎn)圈病”及孕畜發(fā)生流產(chǎn)等癥狀，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來較大的影響。在致病過程中細菌攜帶的鞭毛、菌毛、表面蛋白等[1]毒力因子對細胞的黏附和侵襲以及生物被膜（bacterial biofilm，BF）的形成發(fā)揮著重要作用。細菌的鞭毛在介導(dǎo)黏附時既能通過自身的運動性非特異性增加細菌與受體細胞接觸機率，促進黏附并侵入宿主引發(fā)感染，也能通過鞭毛蛋白特異性與被感染細胞的鞭毛受體結(jié)合來完成細菌的黏附和侵襲[2-3]。腦炎大腸桿菌鞭毛基因缺失后對人腦微血管內(nèi)皮細胞的黏附能力顯著降低[4]，大腸桿菌F18+的鞭毛缺失后對IPEC-1和IPEC-J2細胞的黏附能力也降低[5]。研究表明LM的鞭毛基因（flaA）過表達時能誘導(dǎo)強烈的細胞反應(yīng)[6]。鞭毛介導(dǎo)細菌在液體中的泳動能在BF的形成中起到一定的作用，缺失了flaA基因后單核細胞增生李斯特菌GMYL1447的鞭毛形成缺陷、運動性能喪失，形成BF的能力明顯降低，但缺失株在營養(yǎng)物質(zhì)充裕的環(huán)境中卻能過度生成BF[7-8]。

筆者所在實驗室從發(fā)生“轉(zhuǎn)圈病”的羔羊大腦中分離鑒定了一株LM，命名為LM90SB2。研究表明該分離株攜帶有多種毒力因子，能成功穿越血腦屏障，形成完整的BF，flaA基因缺失能影響細菌的半數(shù)致死量（lethal dose 50，LD50）[9-10]，但對宿主細胞的黏附和侵襲作用以及BF形成規(guī)律的影響并不明確。本研究通過在前期研究基礎(chǔ)上觀察缺失flaA基因的LM LM90SB2-ΔflaA對小鼠巨噬細胞（RAW264.7）和小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（mouse brain microvascular endothelial cells，MBMEC）的黏附和侵襲、不同時間段BF形成能力，分析flaA基因?qū)M毒力影響，為LM致病機制的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 LM LM90SB2株由石河子大學預(yù)防獸醫(yī)實驗室分離鑒定保存，其flaA基因缺失株（LM90SB2-ΔflaA）由作者所在實驗室構(gòu)建；RAW264.7與MBMEC由新疆農(nóng)墾科學院實驗室保存；碘化丙啶（propidium iodide，PI）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的刀豆蛋白A（FITC-ConA）購自美國Sigma公司；高糖DMEM細胞培養(yǎng)液購自Hyclone公司。

1.2 對MBMEC的黏附、侵襲 將MBMEC置于9孔細胞培養(yǎng)板，在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和雙抗（100 U/mL 青霉素和10 μg/mL 硫酸鏈霉素）的DMEM（dulbecco's modified eagle's medium）中培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至細胞單層鋪于培養(yǎng)皿時，將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA菌懸液分別加入細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 h后洗滌并加入裂解液TritonX-100，倍比稀釋后計算黏附MBMEC的細菌數(shù)。

侵襲1 h后用含慶大霉素（100 μg/mL）的細胞完全培養(yǎng)液殺滅胞外細菌，經(jīng)過2 h的作用后PBS洗滌細胞板，按照上述方法統(tǒng)計侵襲入MBMEC的細菌數(shù)。

1.3 對RAW264.7細胞的黏附、侵襲 操作方法同1.2。

1.4 BF定量測定 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA接種于96孔板，分別培養(yǎng)2、6、10、12、24、36、48 h后，加入10%結(jié)晶紫染色，再用乙醇-丙酮溶液溶解，測定D595值，采用SPSS Statistics軟件進行單因素方差分析。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察BF的形成 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA接種于放置有蓋玻片的6孔細胞板中，培養(yǎng)6、24 h后取出蓋玻片，用FITC-ConA和PI染液避光孵育后，在激光共聚焦顯微鏡（200×）觀察BF的形態(tài)。

1.6 小鼠肝臟、脾臟、腎臟載菌量的測定 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA分別以LM90SB2的LD50的三分之二菌量感染小鼠，于感染后第24、48、72 h采集小鼠的肝臟、脾臟和腎臟進行載菌量計數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 對MBMEC黏附和侵襲結(jié)果 黏附MBMEC 1 h后，LM90SB2-ΔflaA的黏附率（1.6%）顯著低于LM90SB2黏附率（2.8%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1；2 h后，侵襲MBMEC細胞的LM90SB2-ΔflaA的侵襲率約為0.058%，LM90SB2侵襲率約為0.065%，兩者差異不顯著，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.2 RAW264.7細胞的黏附和侵襲結(jié)果 黏附RAW264.7細胞1 h后，LM90SB2-ΔflaA的率（5.0%）顯著低于LM90SB2黏附率（8.9%）（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義，見圖1；2 h后，LM90SB2-ΔflaA的侵襲率（2.3%）顯著低于LM90SB2侵襲率（3.3%）具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 BF形成量的測定結(jié)果 LM90SB2-ΔflaA與LM90SB2的BF形成規(guī)律基本相同，均從2 h形成BF，2～10 h BF逐漸增多，10 h時BF形成量進入平穩(wěn)階段，但BF總量兩者存在顯著差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義；10 h后BF處于成熟階段，總量略有下降但總體較平穩(wěn)，解聚與形成過程處于動態(tài)平衡狀態(tài)，10 h后各個時間點LM90SB2-ΔflaA的BF形成量均比LM90SB2形成的低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖1 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA黏附率Fig.1 The adhension of LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

圖2 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA侵襲率Fig.2 The invasion of LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

圖3 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA形成BF的D595值Fig.3 D595 of BF produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察BF的形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果LM90SB2-ΔflaA細菌核酸（紅色熒光）在6 h和24 h時明顯少于LM90SB2，隨著培養(yǎng)時間的延長，即24 h檢測時紅色熒光均明顯增多，見圖4。其多糖物質(zhì)也隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增多（綠色熒光），6 h時可觀察到LM90SB2-ΔflaA帶有綠色熒光多糖，而24 h則出現(xiàn)大量的多糖物質(zhì)，見圖5。與LM90SB2-ΔflaA相比較，LM90SB2也呈現(xiàn)相似規(guī)律，但在每個階段死亡細菌的數(shù)量和多糖產(chǎn)生量明顯多于LM90SB2-ΔflaA，見圖4、5。

圖4 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA不同時間的核酸量Fig.4 Polysaccharides produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA at different time points

圖5 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA不同時間的多糖形成量Fig.5 Polysaccharides produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA at different time points

2.5 肝臟、脾臟、腎臟載菌量的測定結(jié)果 接種后兩組小鼠均出現(xiàn)了精神不振、行動緩慢、被毛雜亂、眼睛分泌物增多等癥狀。分別在接種后第24、48、72 h對小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠肝臟、脾臟、腎臟都出現(xiàn)了明顯的腫大，脾臟病變明顯，從接種48 h后兩組小鼠均出現(xiàn)了脾臟大理石樣變。

肝臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組顯著低于LM90SB2組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6A；脾臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組在各個時間點均低于LM90SB2組的載菌量，但差異不顯著，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6B；腎臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組與LM90SB2組比較，差異不顯著，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6C。

圖6 LM90SB2和LM90SB2-Δ fl aA在小鼠體內(nèi)的載菌量測定結(jié)果Fig.6 The microbial numbers of LM90SB2 and LM90SB2-Δ fl aA in mice

3 討論

LM通過動物的血腦屏障引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患。小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（MBMEC）、小鼠巨噬細胞（RAW264.7）能夠作為模式細胞進行LM相關(guān)研究[11-12]。鞭毛在細菌感染過程可通過自身特點參與宿主細胞的黏附和侵襲[13]。同時在BF形成中使浮游細菌趨化、克服載體表面張力、非活性載體表面的黏附、穩(wěn)定BF結(jié)構(gòu)等作用[14]。如大腸桿菌F18ab的fliC基因缺失后對細胞的黏附和侵襲能以及形成BF的能力降低[4]。編碼LM細胞質(zhì)合成酶的fliI基因缺失后鞭毛形成缺陷，黏附和侵襲上皮細胞與巨噬細胞能力降低[15]。本文通過構(gòu)建LM90SB2flaA基因缺失株發(fā)現(xiàn)缺失株對MBMEC細胞的黏附數(shù)顯著降低，而侵襲數(shù)差異不顯著；對RAW264.7細胞的黏附數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低。推測flaA在LM穿越血腦屏障時發(fā)揮重要作用，但并不參全過程，而flaA缺失能降低細菌對巨噬細胞的黏附和穿入作用。

很多能形成BF的菌株中flaA基因的檢出率極高[16]，比如，空腸彎曲桿菌、霍亂弧菌等缺失flaA基因后BF形成能力降低[17-20]。LM中flaA的表達受flgL基因的調(diào)控，缺失了flaA基因后的GMYL1447與缺失了flgL基因的GMYL1432的BF形成能力明顯降低；但在氧氣、特殊pH、營養(yǎng)充足的工業(yè)模型環(huán)境中的缺失flaA與flgL基因的LM能引發(fā)BF過度形成[8]。本研究通過檢測flaA缺失株時發(fā)現(xiàn)BF形成量下降、BF中的多糖與核酸的含量也明顯減少，表明flaA在一定程度上影響LM90SB2的BF形成。

相同菌量的LM90SB2和LM90SB2-ΔflaA通過腹腔注射感染小鼠后，分別在接種第24、48、72 h對小鼠的肝臟、脾臟、腎臟的載菌量檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠臟器含有的LM90SB2-ΔflaA量始終低于LM90SB2量。說明flaA基因的缺失會影響LM90SB2在各臟器中的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)flaA基因的缺失雖然沒有完全喪失LM90SB2的致病性和毒力，但是flaA基因的缺失確實減弱了LM90SB2的致病性和毒力，同時影響了LM90SB2的BF形成和對細胞的侵害。由此，可初步推測flaA基因的缺失能影響單核細胞李斯特菌致病性等特性，但其中具體作用機制仍需進一步的試驗研究。