顱腦創(chuàng)傷病人S100β、神經(jīng)元特異性烯醇化酶水平變化及其與炎癥因子和凝血指標(biāo)的相關(guān)性研究

黃忻濤，閆青云，王士洲，徐新娟，劉 澤2，馬 寧，張文舉，藥天樂

顱腦創(chuàng)傷(TBI)好發(fā)于中青年，致殘率、致死率高，給社會和家庭帶來巨大的負(fù)擔(dān)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，S100β蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)分別為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后的成分，其血清濃度變化與TBI嚴(yán)重程度及預(yù)后有一定關(guān)系[3]。但目前研究多趨向于單一指標(biāo)，而對TBI后S100β、NSE等反應(yīng)腦損傷程度的指標(biāo)及其他病理變化指標(biāo)(炎癥、凝血等)之間的關(guān)系研究尚少。因此，本研究旨在動態(tài)觀察TBI病人血清S100β、NSE、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和外周血小板計數(shù)的動態(tài)變化以及它們之間的相關(guān)性，為TBI病人病理機(jī)制研究及臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為閉合性顱腦損傷且未手術(shù)或腦室穿刺病人；發(fā)病在入院前24 h之內(nèi)；頭顱CT有陽性發(fā)現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官嚴(yán)重?fù)p傷；患血液系統(tǒng)疾病、癌癥、嚴(yán)重感染、自身免疫性疾病、肝腎功能障礙；入院后3 d內(nèi)死亡者；年齡<16歲或>80歲。共納入2015年9月—2018年9月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科住院治療的TBI病人60例，其中男49例，女11例，年齡17～78歲，平均50歲。致傷原因：交通傷46例，摔傷8例，高處墜落傷3例，打擊傷3例。所有病人損傷均位于小腦幕上，至少存在以下一種類型，其中硬膜外血腫6例，硬膜下血腫15例，腦挫裂傷或腦內(nèi)血腫48例，蛛網(wǎng)膜下腔出血24例，顱骨骨折27例。本研究獲山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并取得受試對象或其親屬的知情同意。另選取20名年齡、性別相匹配的健康人群作為正常對照組。

1.2 觀察指標(biāo) 按照入院時格拉斯哥昏迷評分(GCS)分為輕型組(13～15分，20例)、中型組(9～12分，20例)和重型組(3～8分，20例)。所有病人入院后根據(jù)顱腦創(chuàng)傷救治指南及時給予規(guī)范干預(yù)。在入院后第1天、第4天、第7天和第14天分別采集血液樣本，4 ℃下離心提取上清液，-80 ℃儲存，用ELISA試劑盒檢測S100β、NSE、IL-8、TNF-α的含量，同時檢測相應(yīng)時間點(diǎn)血小板計數(shù)。比較不同組間各項指標(biāo)變化，進(jìn)一步分析損傷嚴(yán)重程度及各指標(biāo)之間的相關(guān)性。ELISA試劑盒購于上海西塘生物有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 各組傷后不同時間點(diǎn)血清S100β、NSE、IL-8、TNF-α的變化 檢測了TBI后病人損傷標(biāo)志S100β、NSE以及炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α的表達(dá)。正常對照組在整個14 d的監(jiān)測期間各指標(biāo)值保持穩(wěn)定。重型組血清S100β水平從傷后第1天開始逐漸下降，第7天和第14天分別與第1天相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而輕型組和中型組在傷后各時間點(diǎn)變化不明顯。不同組間在同一時間比較，重型組S100β水平在傷后各時間點(diǎn)較輕型組、中型組和正常組升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；輕型組、中型組、正常組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖1。各TBI組血清IL-8水平在傷后變化趨勢不明顯。組間比較，在傷后第7天，重型組IL-8水平較輕型組和正常組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；傷后第14天，中型組和重型組IL-8水平較正常組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。血清NSE和TNF-α，無論是組內(nèi)各時間點(diǎn)比較還是同一時間點(diǎn)的組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖3、圖4。

注：與重型組相比，*P<0.05；與第1天相比，#P<0.01。

注：與重型組相比，*P<0.05。

圖3 各組血清NSE的動態(tài)變化

圖4 各組血清TNF-α的動態(tài)變化

2.2 各組傷后不同時間點(diǎn)外周血小板計數(shù)的變化 傷后第14天各TBI組外周血小板計數(shù)與前3個時間點(diǎn)相比均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同損傷程度的TBI組間比較，只有傷后第14天，重型組的血小板計數(shù)較輕型組和中型組升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而輕型組和中型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖5。

注：與重型組相比，*P<0.01；與傷后14 d相比，#P<0.05。

2.3 相關(guān)性分析 檢測傷后TBI各組指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)，采用Pearson法對各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示傷后第1天，各TBI組血清S100β水平與外周血小板計數(shù)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。而在傷后第14天，中型組血清S100β水平與IL-8呈正相關(guān)(P<0.05)，血清NSE水平與IL-8(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)呈正相關(guān)；重型組血清S100β水平與IL-8(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)呈正相關(guān)，血清NSE水平與IL-8(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)呈正相關(guān)。詳見表1、表2。

中型組血清S100β水平僅與IL-8呈正相關(guān)(P<0.05)，而中型組血清NSE水平與IL-8(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)均呈正相關(guān)；重型組血清S100β水平與IL-8(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)均呈正相關(guān)，同樣血清NSE水平與IL-8(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)也均呈正相關(guān)。

表1 各TBI組傷后第1天血清S100β與外周血小板計數(shù)的相關(guān)性分析

表2 各TBI組傷后第14天血清S100β、NSE與IL-8、TNF-α的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究根據(jù)入院時GCS評分進(jìn)行分組，分為輕型組、中型組、重型組。結(jié)果顯示重型組血清S100β水平從傷后第1天開始逐漸下降，重型組S100β水平在傷后各時間點(diǎn)較輕型組、中型組和正常組升高，輕型組、中型組、正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而對于血清NSE，無論是組內(nèi)各時間點(diǎn)比較還是同一時間點(diǎn)組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。檢測炎性細(xì)胞因子和血小板的變化，進(jìn)一步相關(guān)性分析得出，傷后第1天，TBI各組血清S100β水平與外周血小板計數(shù)均呈負(fù)相關(guān)；在傷后第14天，中型組、重型組血清S100β、NSE水平與IL-8、TNF-α呈正相關(guān)。

目前，對于TBI后腦損害程度及預(yù)后的評估一直是臨床研究的熱點(diǎn)，近年來許多研究集中于S100β和NSE。S100β是低分子量的鈣結(jié)合蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的施萬氏細(xì)胞。NSE是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，特異定位于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。二者分別反映白質(zhì)和灰質(zhì)損傷程度[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞受損時，S100β和NSE可釋放并經(jīng)受損的血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)。最近也有研究表明，顱內(nèi)類淋巴系統(tǒng)也可能參與釋放過程并獨(dú)立于血腦屏障[4]。

S100β和NSE可參與多種病理過程，二者與腦缺氧、顱內(nèi)壓升高、腦灌注不足有關(guān)。尤其在TBI的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸方面，以上指標(biāo)可評估腦損傷的嚴(yán)重程度，還可作為評價療效和選擇治療方案的重要指標(biāo)。已有研究表明，TBI后早期血清S100β、NSE濃度與入院時GCS、傷后6個月格拉斯哥預(yù)后評分(GOS)有關(guān)[5-6]。本研究得出重型組血清S100β水平從傷后第1天開始逐漸下降，重型組S100β水平在傷后各時間點(diǎn)較輕型組、中型組和正常組升高，說明S100β與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，這與以往研究結(jié)果一致。但對于NSE卻未得出陽性結(jié)果。血清S100β和NSE濃度在長期凍存中可保持穩(wěn)定，但NSE會因紅細(xì)胞溶血而產(chǎn)生的異常升高，而S100β不會因溶血而受影響因?yàn)槠洳⒉淮嬖谟诩t細(xì)胞中[7]。因此，本研究與以往研究結(jié)果的差異可能與不同的試劑及采血、離心過程中溶血等有關(guān)。由于血清S100β的穩(wěn)定性及更強(qiáng)的預(yù)測能力，已經(jīng)被編入一些國家的TBI治療指南，而NSE還遠(yuǎn)未到此程度[3]。

生理濃度的S100β可以促進(jìn)軸突生長和神經(jīng)元修復(fù)，但高濃度S100β可通過RAGE (receptor for advanced glycation end products) 通路激活星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和一氧化氮(NO)，促炎因子白介素1(interleukin-1，IL-1)進(jìn)一步刺激星形細(xì)胞活化和增殖產(chǎn)生大量的S100β蛋白，從而形成正反饋調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能的紊亂。因此，S100β可能不僅是反映TBI嚴(yán)重性及預(yù)后的標(biāo)志，高濃度的S100β更可能是導(dǎo)致?lián)p傷加重的原因[8]。TNF-α是TBI后最早升高的細(xì)胞因子，還可以誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子(如白介素家族)的產(chǎn)生，它既有神經(jīng)毒性也具有神經(jīng)保護(hù)作用；IL-8屬于嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，特異性較強(qiáng)，在TBI后炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色[9-11]。本研究相關(guān)性分析表明，TBI后亞急性期(第14天)S100β、NSE的表達(dá)與炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)，說明越嚴(yán)重的病人IL-8、TNF-α濃度也越高。提示炎癥反應(yīng)在TBI亞急性期參與并加重繼發(fā)性腦損傷的病理生理過程，影響功能恢復(fù)。二者相關(guān)性也提示在TBI亞急性期從抑制炎癥反應(yīng)的角度來進(jìn)行藥物治療。

TBI引起的凝血功能障礙與臨床不良預(yù)后有關(guān)[12-13]。但TBI病人并不像其他創(chuàng)傷病人一樣存在顱外創(chuàng)傷、失血性休克以及大量液體輸入等引起凝血功能障礙的關(guān)鍵因素，最新研究表明TBI后腦源性微粒(brain-derived microparticles， BDMPs)從中樞釋放入外周循環(huán)，這些BDMPs表達(dá)腦組織富含的組織因子和磷脂酰絲氨酸，因此具有高度的促凝作用，BDMPs的釋放引起系統(tǒng)性高凝以及隨后的消耗性低凝，二者可以同時發(fā)生[14-17]。傷后消耗性低凝導(dǎo)致機(jī)體反應(yīng)性調(diào)節(jié)血小板生成的巨核系集落刺激因子和促血小板生成素增多，導(dǎo)致TBI后期血小板生成增加[18]。本研究得出傷后第14天各組外周血小板計數(shù)與前3個時間點(diǎn)相比均升高，傷后第14天，重型組血小板計數(shù)較輕型組和中型組升高。因此，血小板的動態(tài)變化可能與TBI病人嚴(yán)重性有關(guān)，TBI后期再次出現(xiàn)高凝狀態(tài)應(yīng)給予重視，尤其是對于重型TBI并長期臥床病人，后期高凝狀態(tài)可能會引起繼發(fā)性腦缺血及深靜脈血栓，必須及早發(fā)現(xiàn)并采取措施。同時本研究還顯示，傷后第1天，各組血清S100β水平與外周血小板計數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，提示TBI后早期越嚴(yán)重的病人血小板計數(shù)越低，出血風(fēng)險越高。早期的出血傾向和隨后的血栓形成使治療更為復(fù)雜，隨著TBI病人發(fā)病年齡的增加，老年病人存在更多的伴隨疾病和抗血小板或抗凝藥物消耗，這些都會增加傷后出血風(fēng)險，受傷前口服抗凝藥華法令可增加傷后的死亡率，但口服阿司匹林或氯吡格雷等抗血小板藥是否會伴隨著出血增加以及不良預(yù)后仍有爭議[19-20]。因此，進(jìn)一步探討凝血功能各指標(biāo)與相關(guān)危險因素之間的關(guān)系，可從另一角度提供理論依據(jù)。

本研究對病人住院期間的炎癥因子及凝血指標(biāo)進(jìn)行初步研究，未能對TBI病人各指標(biāo)與術(shù)后遠(yuǎn)期的療效包括格拉斯哥預(yù)后評分(GOS)、日常生活指數(shù)(ADL-BI)等進(jìn)行分析，這需要更長時間的隨訪觀察及進(jìn)一步的研究。