正常鹽飲食狀態(tài)下醛固酮增多對(duì)大鼠心肌的影響及其機(jī)制研究

心肌纖維化是多種心血管疾病導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、衰竭的終末期表現(xiàn)，其主要病理表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外膠原蛋白過(guò)度沉積，病因十分復(fù)雜，相關(guān)調(diào)控機(jī)制受多種因素影響[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而醛固酮作為RAAS中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮不僅是一個(gè)可致多器官纖維化的活性因子，而且是一個(gè)促炎反應(yīng)因子和促血管鈣化因子[2-4]，是獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性醛固酮不僅可導(dǎo)致大鼠主動(dòng)脈纖維化改變，同時(shí)有研究亦發(fā)現(xiàn)醛固酮增多可導(dǎo)致心肌纖維化[5]，但其可能涉及的分子途徑尚未完全明了。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)擬在正常鹽飲食情況下觀察醛固酮增多對(duì)大鼠心肌的影響，并初步探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 8周齡雄性SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。醛固酮購(gòu)自Sigma公司，血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)放免試劑盒購(gòu)自北京華英公司，MCP-1受體一抗購(gòu)自北京博奧森公司，二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本收集 16只雄性SD大鼠隨機(jī)分兩組，每組8只。 正常對(duì)照組：給予等量的生理鹽水肌內(nèi)注射；醛固酮組：采用醛固酮皮下注射(20 μg/d)，常規(guī)飼養(yǎng)6周。稱重后2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，置入含有促凝劑的試管中，靜置析出血清，4℃離心10 min，分離血清，-70 ℃保存。摘取心臟，用冰生理鹽水沖洗后稱重，切除部分心肌組織，石蠟包埋用于染色。

1.3 心肌組織膠原Masson染色 取大鼠心肌組織石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化、脫水，Masson復(fù)合染色液5 min，0.2%醋酸水溶液稍洗，5%磷鎢酸5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次，經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 放射免疫法檢 測(cè)心肌組織和血清MCP-1的表達(dá) 取大鼠心肌組織和血清標(biāo)本，送至北京華英生物研究所，采用放射免疫法檢測(cè)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織MCP-1受體的表達(dá) 取大鼠心肌組織石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)、封閉非特異性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，具體按說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 Masson染色 Masson染色觀察心肌組織膠原沉積，醛固酮組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白明顯沉積。詳見(jiàn)圖1。

正常對(duì)照組 醛固酮組

注：藍(lán)色為膠原成分。

圖1大鼠心肌細(xì)胞Masson染色(×40)

2.2 大鼠血清MCP-1表達(dá)和心臟/體重比的變化 醛固酮組血清MCP-1的表達(dá)和心臟/體重比明顯高于正常組。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清MCP-1含量和心臟/體重比的比較(±s)

與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01。

2.3 大鼠心肌組織MCP-1 受體表達(dá)的變化 免疫組化染色顯示，醛固酮組大鼠心肌組織MCP-1受體的表達(dá)明顯高于正常組。詳見(jiàn)圖2。

正常對(duì)照組 醛固酮組

注：棕色為陽(yáng)性表達(dá)。

圖2大鼠心肌細(xì)胞MCP-1受體染色 (×100)

3 討 論

心肌纖維化是高血壓、心肌梗死及心肌病多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，其主要病理表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中成纖維細(xì)胞增殖，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積[1]。臨床研究亦證實(shí)，醛固酮增多病人對(duì)比相同血壓水平的原發(fā)性高血壓病人，左心室肥厚及纖維化更明顯，心血管疾病發(fā)生概率更高[6]。提示醛固酮致心肌纖維化作用是獨(dú)立于高血壓的。因此，醛固酮單獨(dú)可引起血壓升高和心臟病變，并且在不依賴高鹽狀態(tài)下是獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素[4]。在正常鹽飲食或高鹽飲食狀態(tài)下單純給予醛固酮均可誘導(dǎo)心肌纖維化、心肌肥厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)[4-5，7]。外源性醛固酮還可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原蛋白合成[8]，而細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過(guò)程中重要的病理?xiàng)l件。由此可見(jiàn)，醛固酮與心血管疾病密切相關(guān)，是重要的促纖維化物質(zhì)，可能涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、NF-κB及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smads等信號(hào)通路[9-10]。

本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)對(duì)正常鹽飲食大鼠，采用外源性醛固酮干預(yù)6周后，大鼠心肌組織出現(xiàn)纖維化情況，組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白明顯沉積，并且心臟/體重比明顯增加，提示心肌纖維化和心肌肥大，與國(guó)內(nèi)學(xué)者研究[5]一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)醛固酮組大鼠血清MCP-1濃度明顯上升高，同時(shí)心肌組織MCP-1受體的表達(dá)明顯上調(diào)，提示醛固酮不僅可誘導(dǎo)心肌纖維化，還可促進(jìn)大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可能是一個(gè)獨(dú)立的促炎癥反應(yīng)因子。

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)炎癥因子如MCP-1表達(dá)與心肌梗死后心肌重構(gòu)密切相關(guān)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)心肌組織如巨噬細(xì)胞、炎癥因子分泌亦相應(yīng)增多，促進(jìn)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及肌成纖維形成，引起心肌重構(gòu)[11-12]，用加參方干預(yù)可抑制炎癥因子表達(dá)，從而改善心肌重構(gòu)。MCP-1是一種經(jīng)典的炎癥細(xì)胞趨化因子，與MCP-1受體結(jié)合后，可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶和PI3K-蛋白激酶B(AKT)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用，激活多種炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，從而誘導(dǎo)各種炎癥細(xì)胞遷移、聚集，并分泌各種炎癥反應(yīng)介質(zhì)，如白介素、腫瘤壞死因子等，通過(guò)氧化應(yīng)激等生物學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致局部組織細(xì)胞增殖、膠原沉積等，并且炎癥反應(yīng)貫穿心血管重構(gòu)的始終[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常鹽飲食狀態(tài)下，單純給予醛固酮不僅可導(dǎo)致心肌組織纖維化，還可上調(diào)機(jī)體MCP-1及其受體的表達(dá)，提示醛固酮亦是促炎因子，通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)可能是醛固酮致心肌纖維化的重要分子機(jī)制之一，這將為心肌纖維化的機(jī)制研究及防治提供新的思路和作用靶點(diǎn)。