曲美他嗪對(duì)心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、自噬以及心功能的保護(hù)作用

心肌梗死是心內(nèi)科常見的臨床急癥，心肌細(xì)胞的再生能力有限，缺血壞死后導(dǎo)致后期心室重構(gòu)，從而導(dǎo)致心功能不全或者心力衰竭發(fā)生。快速恢復(fù)血供，預(yù)防后期心室重構(gòu)是目前心肌梗死治療的主要方法[1]，雖然近年來干細(xì)胞移植、基因編程等治療方法應(yīng)用到心肌梗死的治療研究中，但是藥物治療仍然是保護(hù)心肌的常用方法[2]。臨床研究顯示曲美他嗪在冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建過程中可以發(fā)揮作用，促進(jìn)心肌代謝及心肌能量的產(chǎn)生[3]；臨床和實(shí)驗(yàn)研究均顯示曲美他嗪可以保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，常用于心肌梗死的治療[4]。本研究通過構(gòu)建心肌梗死大鼠模型，觀察曲美他嗪對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、自噬以及心功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，由海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量190～220 g，清潔級(jí)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，建立心肌梗死模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)造模 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，心電圖機(jī)連接大鼠四肢，左側(cè)胸前區(qū)備皮消毒后胸骨左側(cè)第3肋和第4肋間切開皮膚，依次分離肌肉、組織，40只SD大鼠暴露心臟后用6-0號(hào)無創(chuàng)縫合線于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距離主動(dòng)脈根部 1 mm處結(jié)扎前降支，縫線下方心肌變白、運(yùn)動(dòng)減弱，心電圖Ⅱ?qū)?lián)見ST段弓背向上，為造模成功，將40只造模成功SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和曲美他嗪組。另外20只SD大鼠作為假手術(shù)組，僅僅在前降支下穿線不做結(jié)扎。所有模型鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管撤機(jī)。假手術(shù)組和對(duì)照組不做處理，曲美他嗪組給予10 mg/(kg·d)曲美他嗪灌胃，連續(xù)給藥28 d。

1.3 心功能檢測(cè) 手術(shù)前和術(shù)后第28天，使用彩超，頻率13 MHz，測(cè)定左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS) 和射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.4 心肌細(xì)胞凋亡原位檢測(cè) TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，試劑盒購自美國Millipore公司，按照說明書操作。第28天試驗(yàn)完成后斷頸處死所有動(dòng)物，心肌梗死區(qū)取材，常規(guī)石蠟包埋、切片后使用TUNEL試劑盒染色，凋亡細(xì)胞染為棕色，200×顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)(PI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 心肌細(xì)胞自噬蛋白的Western Blot檢測(cè) 第28天試驗(yàn)完成后斷頸處死所有動(dòng)物，心肌梗死區(qū)取材，液氮下研磨，提取細(xì)胞總蛋白，80 V SDS-PAGE凝膠電泳蛋白2 h后，100 V電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，加入LC3Ⅱ抗體(美國cell signal公司)孵育過夜后，加入二抗，2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，膠片曝光顯示目的條帶，β-actin作為內(nèi)對(duì)照。Bandscan軟件掃描后計(jì)算LC3Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即相對(duì)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間均數(shù)比較進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組術(shù)后存活率比較 假手術(shù)組大鼠無死亡，存活率為100.0%，對(duì)照組死亡9只，存活11只，存活率為55.0%，曲美他嗪組死亡4只，存活16只，存活率為80.0%。3組間死亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組術(shù)后心肌凋亡指數(shù)比較 假手術(shù)組、對(duì)照組和曲美他嗪組術(shù)后第28天缺血心肌細(xì)胞PI值分別為(0.76±0.23)%、(21.52±6.57)%和(12.38±2.15)%，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖1。

圖1 心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)

2.3 3組術(shù)后心肌自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)的比較 經(jīng)灰度掃描后，假手術(shù)組、對(duì)照組和曲美他嗪組心肌自噬蛋白LC3Ⅱ相對(duì)灰度值分別為0.17±0.03，0.46±0.12，0.68±0.15，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖2。

圖2 3組心肌自噬蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)比較

2.4 3組大鼠心功能比較 3組手術(shù)前LVESD、FS 和EF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后28 d，假手術(shù)組LVESD、FS和EF變化與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但對(duì)照組和曲美他嗪組LVESD較術(shù)前升高(P<0.05)，F(xiàn)S和EF減低(P<0.05)，且術(shù)后28 d曲美他嗪組LVESD低于對(duì)照組(P<0.05)，而FS和EF高于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組LVESD、FS和EF指標(biāo)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P<0.05，②P<0.01；與對(duì)照組比較，③P<0.05；與本組手術(shù)前比較，④P<0.05。

3 討 論

心肌細(xì)胞屬于穩(wěn)定細(xì)胞，基本不能再生，缺血后心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞損傷或丟失的主要表現(xiàn)形式[4]，誘發(fā)了心室重構(gòu)加劇以及后期的心功能不全[5]。孫靜等[6]應(yīng)用Vinexin-β 基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)抑制心肌細(xì)胞凋亡后，可以減少梗死心肌面積以及保護(hù)心功能。

細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，自噬在心肌細(xì)胞能量代謝中占有重要地位，功能紊亂或受損細(xì)胞質(zhì)成分在自噬溶酶體作用下分解為能量物質(zhì)，雖然目前對(duì)心肌梗死中自噬功能作用仍存有爭(zhēng)議，但多數(shù)研究認(rèn)為適當(dāng)?shù)淖允蓪?duì)心臟損傷的修復(fù)以及功能起到保護(hù)作用。心肌缺血時(shí)ATP水平降低，細(xì)胞能量感受器AMPK-mTORC1-ULK1 信號(hào)通路激活，激活位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的beclin-1蛋白，導(dǎo)致了自噬[7]。自噬對(duì)心肌的相關(guān)保護(hù)機(jī)制為：自噬分解受損細(xì)胞器給細(xì)胞提供能量，可以緩解受損心肌細(xì)胞的能量危機(jī)；抑制受損的線粒體誘發(fā)的過量活性氧產(chǎn)生，促進(jìn)功能紊亂線粒體的更新；清除過激反應(yīng)蛋白維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8]。心肌梗死時(shí)常常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的自噬活動(dòng)增強(qiáng)，就可以釋放出大量的能量物質(zhì)，補(bǔ)充心肌缺血造成的能量危機(jī)[9]。自噬體膜型(LC3Ⅱ)是自噬標(biāo)志物，LC3-Ⅱ增多說明自噬過程激活，班努·庫肯等[10]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠模型自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)顯著增加，參與受損心肌的修復(fù)。

近期有研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡和自噬可以通過一些通路聯(lián)系起來。Wang等[11]研究顯示當(dāng)心肌細(xì)胞自噬減少時(shí)凋亡就會(huì)增加；Zhang等[12]在糖尿病性心肌病大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)早期給予曲美他嗪可以降低心肌細(xì)胞凋亡，增加自噬。本研究探討了心肌細(xì)胞缺血時(shí)曲美他嗪對(duì)受損細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用，為心肌梗死的治療提供新思路。LC3Ⅱ是一種自噬激活的標(biāo)志性蛋白，其水平升高可以反映細(xì)胞自噬的增加，本研究觀察到曲美他嗪組LC3Ⅱ表達(dá)水平高于對(duì)照組，說明曲美他嗪加強(qiáng)了缺血心肌細(xì)胞自噬的激活，增強(qiáng)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)性自噬反應(yīng)。譚淑娜等[13]在心力衰竭大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了曲美他嗪可以升高缺血心肌細(xì)胞的自噬應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮心功能保護(hù)作用。本研究顯示曲美他嗪組對(duì)LVESD、FS和EF的改善作用優(yōu)于對(duì)照組，說明了曲美他嗪有利于心肌梗死大鼠心功能的修復(fù)。

綜上所述，曲美他嗪有助于大鼠心功能恢復(fù)，減少心肌細(xì)胞凋亡和增加心肌自噬。