不同結(jié)晶度幾丁質(zhì)納米晶體制備皮克林乳液穩(wěn)定性研究

李 楊 劉 曌 胡 淼 謝鳳英,2 王 嬋 齊寶坤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，哈爾濱 150028)

0 引言

皮克林乳液是指由固態(tài)顆粒或固態(tài)膠體顆粒穩(wěn)定的乳液[1]。前期主要研究利用無機(jī)粒子(例如二氧化硅等)穩(wěn)定的皮克林乳液[2]，隨著乳液在食品行業(yè)的發(fā)展，食品級(jí)顆粒越來越受到研究者的重視。目前，常用的食品級(jí)顆粒主要有纖維素、淀粉和幾丁質(zhì)[3-5]。幾丁質(zhì)作為一種線性多糖，含量豐富，來源廣，成本低[6-7]。但天然幾丁質(zhì)分子量大，不溶于水、稀酸、堿及有機(jī)溶劑，因此需要對其進(jìn)行改性。研究發(fā)現(xiàn)，改性幾丁質(zhì)比改性淀粉及纖維素具有更高的吸附活力，當(dāng)顆粒不可逆地吸附在油-水界面時(shí)，液滴之間的空間位阻效應(yīng)阻礙了液滴的聚集，使其穩(wěn)定的皮克林乳液具有對聚結(jié)和奧氏熟化的優(yōu)異穩(wěn)定性[1-2]。pH值與溫度對皮克林乳液的影響已經(jīng)有相關(guān)研究[8]，而幾丁質(zhì)納米晶體的結(jié)晶度與乳液穩(wěn)定性之間的關(guān)系尚不明確。

本文通過酸解改性幾丁質(zhì)，探究酸解后得到的幾丁質(zhì)納米晶體結(jié)晶度對乳液穩(wěn)定性的影響。利用低溫掃描電子顯微鏡觀察乳液形貌，用接觸角分析儀測量乳液的界面接觸角，并從熱穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性、乳析穩(wěn)定性以及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性4方面研究幾丁質(zhì)納米晶體對皮克林乳液穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

幾丁質(zhì)(Chitin)，上海源葉有限公司；葵花籽油，北京金世倉糧油貿(mào)易有限公司；透析袋(12～14 kDa)，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersizer 2000型粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；UTL2000型乳化機(jī)，德國 IKA儀器設(shè)備公司；凍干機(jī)，上海匯分電子科技有限公司；pHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海雷磁公司；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；銳影X射線衍射系統(tǒng)，荷蘭帕納科公司；OCA20型視頻接觸角測量儀，德國DATA PHYSICS儀器股份有限公司；低溫掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1幾丁質(zhì)納米晶體制備

用3 mol/L HCl水解幾丁質(zhì)，水解時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，水解后去除無規(guī)則晶體得懸浮液，將懸浮液用4℃蒸餾水稀釋10倍，停止水解反應(yīng)，6 000g離心15 min，重復(fù)水洗兩次離心除去多余的酸。析出物經(jīng)透析膜(12～14 kDa)沖洗透析至pH值恒定(4 d)。然后，將懸浮液超聲處理(300 W，10 min，超聲10 s，間隔2 s)，得到分散均勻的幾丁質(zhì)納米晶體(Chitin nanocrystals, ChN)懸浮液。采用冷凍干燥法制備不同結(jié)晶度的ChN粉末。

1.3.2X射線衍射測定

使用X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)系統(tǒng)測定樣品的X射線衍射圖譜來確定不同酸解時(shí)間下納米晶體的結(jié)晶度。其中CuKα輻射參數(shù)設(shè)置如下：波長0.154 1 nm，電壓40 kV，燈絲電流30 mA，掃描速率為1(°)/min，2θ(衍射角)范圍是5°～60°。結(jié)晶度(Crystallinity index value, CrI)計(jì)算公式為

(1)

式中I110——在2θ=19°時(shí)衍射的最大強(qiáng)度

Iam——非結(jié)晶部分(2θ=12.6°)的強(qiáng)度

1.3.3傅里葉紅外光譜測定

通過傅里葉紅外光譜(Fourier infrared spectroscopy, FTIR)儀測定不同酸處理時(shí)間對幾丁質(zhì)顆粒官能團(tuán)的影響。傅里葉紅外光譜儀參數(shù)設(shè)置：分辨率為4 cm-1，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1，掃描頻率32次/s。取2 mg待測樣品與溴化鉀按質(zhì)量比1∶100混合后壓片，測定ChN的紅外光譜。

1.3.4O/W型皮克林乳液制備

將不同結(jié)晶度的ChN粉末加入到pH值為3的去離子水中配制成1%的懸濁液，之后加入葵花籽油(體積分?jǐn)?shù)10%)，在10 000 r/min下連續(xù)均質(zhì)2 min，然后在400 W下冰水浴超聲處理15 min(超聲10 s，間隔2 s)制備成最終的O/W型皮克林乳液。

1.3.5低溫掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻(xiàn)[9-10]的方法通過低溫掃描電子顯微鏡(Cryo-SEM)對乳液的界面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。將所制備的乳液分別放入銅樣品托上并浸泡于液氮中快速冷凍。在真空條件下，將樣品轉(zhuǎn)移到安裝在掃描電鏡樣品艙端口上的制樣艙中冷臺(tái)上，進(jìn)行冷凍斷裂，在-95℃冷凍升華15 min并進(jìn)行濺射鍍膜處理。最后，將樣品在真空條件下轉(zhuǎn)移至樣品艙中的冷臺(tái)上在-130℃下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.6界面接觸角測定

使用接觸角分析儀測定水對乳液的界面接觸角。將乳液涂于載玻片晾干，使其形成厚度為2 mm的薄膜。使用高精度注射器將一滴水(5 μL)滴入薄膜表面，立即用攝像機(jī)記錄液滴圖像。對液滴輪廓線用Laplace-Young方程擬合進(jìn)行數(shù)值求解，每個(gè)樣品作3次平行，每一個(gè)平行樣品選取3處測量3個(gè)接觸角，并對每個(gè)顆粒進(jìn)行3次測量[4]。

1.3.7熱穩(wěn)定性測定

參照文獻(xiàn)[11-12]的離心分離法測定皮克林乳液的熱穩(wěn)定性。將制成的乳液于80℃水浴下30 min并立即放入冰水浴中保存15 min，用直尺準(zhǔn)確測量乳液的總高度，最后在25℃下1 300g離心5 min，用直尺測量乳液離心后上層乳劑的高度。乳液的熱穩(wěn)定性(Emulsion thermal stability, ETS)指數(shù)計(jì)算公式為

(2)

式中HInt——離心前乳液的初始高度

HCen——離心后上層乳劑的高度

1.3.8物理穩(wěn)定性測定

采用離心分離法[11-12]測定。將新制備的乳液放入離心管中，直尺測量乳液初始高度，25℃下2 500g離心5 min，用直尺測量乳液離心后上層乳劑的高度。乳液物理穩(wěn)定性(Emulsion physical stability,EPS)指數(shù)計(jì)算公式同ETS指數(shù)。

1.3.9乳析穩(wěn)定性測定

圖1 不同酸解時(shí)間下ChN的X-射線衍射圖及結(jié)晶度

參照文獻(xiàn)[13]的方法測定。將制備好的乳液分別置于10 mL的具塞比色管中，加入少量疊氮化鈉以防止微生物生長，用玻璃塞密封并在25℃下放置7 d，每天用直尺對乳清層進(jìn)行精確測量并記錄。乳析穩(wěn)定性通常采用乳析指數(shù)(Creaming index,CI)表示，計(jì)算公式為

(3)

式中HS——乳清層的高度，cm

HT——比色管中乳液的總高度，cm

1.3.10儲(chǔ)藏穩(wěn)定性測定

將O/W乳液常溫儲(chǔ)藏30 d測定其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。乳液的平均粒徑通過使用Mastersizer 2000型粒度儀測量得到。將0 d和30 d的皮克林乳液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值為7)稀釋1 000倍進(jìn)行測量并分析比較。參數(shù)設(shè)置如下：顆粒折射率為1.560，連續(xù)相折射率為1.330，吸收參數(shù)為0.010。測定溫度為25℃，平衡時(shí)間為120 s。并對0 d和30 d的乳液進(jìn)行拍攝對比。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)測定，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)采用Duncan’s單因素方差分析，采用SPSS 20.0軟件對所測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，用Origin 8.5軟件繪制趨勢曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChN結(jié)晶度

XRD是通過對材料進(jìn)行X射線衍射分析其衍射圖譜，可表征材料的結(jié)構(gòu)或形態(tài)。文獻(xiàn)[14]表明ChN在2θ=9.4°，12.7°，19.3°，23.1°，26.6°處有衍射峰。由圖1a可知，ChN在經(jīng)過1.0 h(2θ=9.2°,12.8°,19.3°,23.4°,26.5°)、1.5 h(2θ=9.3°,12.5°,19.1°,23.1°,26.2°)、2.0 h(2θ=9.4°,12.7°,19.2°,23.2°,26.3°)、2.5 h(2θ=9.3°,12.7°,19.2°,23.3°,26.4°)、3.0 h(2θ=9.2°,12.5°,19.2°,23.1°,26.3°)酸解處理后，也在相應(yīng)的位置觀察到衍射峰，說明這是ChN的典型特征峰。經(jīng)計(jì)算得到5個(gè)酸解時(shí)間的ChN結(jié)晶度，如圖1c所示。結(jié)果表明在2.5 h內(nèi)結(jié)晶度隨酸解時(shí)間的增加而增加，而過度的酸解會(huì)導(dǎo)致ChN的結(jié)晶度下降。因此，2.5 h的酸解時(shí)間得到的ChN結(jié)晶度最高，為78.15%，說明原料經(jīng)過2.5 h的酸解后其中的無定形部分最大程度地被破壞；而之后隨著酸解時(shí)間的增長，結(jié)晶度下降，可能是因?yàn)檫^度酸處理在破壞了無定形部分后繼續(xù)破壞了有序結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)[5]的研究相似，但與其結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)中ChN的結(jié)晶度略低，原因歸結(jié)于原料及處理環(huán)境的不同。

2.2 傅里葉紅外光譜

圖3 不同結(jié)晶度ChN穩(wěn)定的皮克林乳液低溫掃描電子顯微鏡圖

2.3 低溫掃描電鏡圖像

低溫掃描電鏡是觀察乳液界面結(jié)構(gòu)最有利技術(shù)之一,可以觀察到平均粒徑小于100 nm的顆粒界面處填充結(jié)構(gòu)，這使它能夠在乳液界面上原位表征納米級(jí)顆粒[1]。從圖3可以看出，未經(jīng)酸解的幾丁質(zhì)不能形成納米晶體，且聚集在一起，無法對乳液進(jìn)行包裹，不能形成多糖皮克林乳液典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而經(jīng)過酸解之后形成的ChN不同程度地附著在乳液表面，形成了典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說明幾丁質(zhì)必須改性破壞其無定形區(qū)域才能附著于乳液表面，形成穩(wěn)定乳液。如圖3所示，酸解1.5、2.0、2.5 h的ChN大量附著在乳液表面，充分包裹液滴，與不存在界面穩(wěn)定劑的體系相比，顆粒的存在可以增強(qiáng)聚結(jié)[21]。比較發(fā)現(xiàn)高結(jié)晶度的ChN顆粒更小，液滴表面附著更多，乳液的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更明顯，這可能是結(jié)晶度越高，在高壓均質(zhì)處理時(shí)，巨大的壓降使得液體顆粒從噴嘴噴出瞬間高度破碎，被分散成更小的顆粒[22]，進(jìn)而更多地包裹在乳液表面(圖3)，使其具有更高的穩(wěn)定性。

2.4 界面接觸角

界面接觸角指在氣、液、固三相交點(diǎn)處所作的氣-液界面的切線，是表征顆粒乳化劑吸附行為的一個(gè)重要參數(shù)，與液-固交界線之間的夾角為α，用來表示潤濕程度[8]。α<90°表示固體表面為親水性，其值越小，則潤濕性越好；α>90°表示固體表面是疏水性[23]。圖4顯示了不同結(jié)晶度ChN制備的乳液接觸角，由圖4可知，乳液均為親水性，但親水程度不同。原始幾丁質(zhì)穩(wěn)定的乳液(圖4a)α最大，為71.1°，表明制備的乳液親水性最差。經(jīng)過酸解后幾丁質(zhì)穩(wěn)定的乳液接觸角變小，說明乳液的親水性增加，并且可以看出，結(jié)晶度最高的ChN穩(wěn)定的乳液(圖4e)測得接觸角最小，為36.6°，減小了一半左右，說明乳液的親水性大大提高，原因可能是結(jié)晶度高的ChN經(jīng)過均質(zhì)及超聲處理后具有更高的比表面積，能更多地吸附于乳液界面，使乳液與水之間有更多的接觸[24]，形成更小的接觸角，從而說明乳液表面附著更多納米顆粒，穩(wěn)定性更好。

圖4 不同結(jié)晶度ChN穩(wěn)定的皮克林乳液界面接觸角

2.5 O/W型皮克林乳液的熱穩(wěn)定性及物理穩(wěn)定性

采用離心分離法測定皮克林乳液的抗應(yīng)力穩(wěn)定性。由圖5(圖中同一參數(shù)的不同字母表示差異顯著，P<0.05)可知，結(jié)晶度低的ChN穩(wěn)定的皮克林乳液的熱穩(wěn)定性較低，這與文獻(xiàn)[12]研究相似；而結(jié)晶度最高的ChN制備的乳液熱穩(wěn)定性指數(shù)最高，為63%；酸解1.0、1.5、2.0 h制備的ChN穩(wěn)定的O/W乳液具有相近的物理穩(wěn)定性，而酸解2.5 h制備的ChN穩(wěn)定的O/W乳液物理穩(wěn)定性指數(shù)最高，為69.52%。綜上，結(jié)晶度高的ChN穩(wěn)定的乳液熱穩(wěn)定性及物理穩(wěn)定性高，可能是因?yàn)榻Y(jié)晶度高的ChN粒徑更小，具有更大的比表面積，親水性更高，能更充分緊密地吸附在界面上，使乳液不易被破壞[25]。

圖5 不同結(jié)晶度ChN穩(wěn)定的皮克林乳液ETS指數(shù)和EPS指數(shù)

2.6 乳析穩(wěn)定性

圖6 不同結(jié)晶度ChN穩(wěn)定的皮克林乳液乳層析指數(shù)

圖6為皮克林乳液貯藏7 d的乳析指數(shù)CI變化。如圖所示，未經(jīng)酸解的ChN形成的皮克林乳液乳析指數(shù)最大，說明乳液分層最明顯，乳析穩(wěn)定性最差。而經(jīng)過酸水解ChN制備的皮克林乳液CI顯著低于未經(jīng)酸解的ChN制備的乳液(P<0.05)，并且乳液在貯藏4 d之后CI幾乎保持不變。結(jié)果顯示酸解2.0 h和2.5 h形成的納米晶體制備的乳液CI最低，不足1%，說明這兩種乳液的乳析穩(wěn)定性最好。文獻(xiàn)[26]測定了大豆分離蛋白與殼聚糖復(fù)合物穩(wěn)定的乳液乳析指數(shù)，最低為45.8%，而本研究乳液的乳析指數(shù)大大減小，可能是因?yàn)楫?dāng)顆粒達(dá)到一定的結(jié)晶度，具有了更小的界面接觸角，一旦它們附著到油-水界面，就被有效且不可逆地吸附[27]。冷凍掃描電鏡圖像也觀察到顆粒不同程度地吸附在液滴表面，且結(jié)晶度高的納米晶體能更多地附著在表面以更好地穩(wěn)定乳液，使乳液具有更高的乳析穩(wěn)定性。

圖7 不同結(jié)晶度ChN穩(wěn)定的皮克林乳液平均粒徑

2.7 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

通過粒度儀測定了乳液制備0 d和常溫儲(chǔ)藏30 d的平均粒徑，如圖7(圖中同一儲(chǔ)藏時(shí)間不同字母表示差異顯著，P<0.05)所示。ChN穩(wěn)定的皮克林乳液0 d時(shí)平均粒徑高達(dá)16 μm，而經(jīng)過酸水解的ChN穩(wěn)定的皮克林乳液平均粒徑不足5 μm，粒徑明顯減?。晃墨I(xiàn)[28]的研究表明，酸解1.5 h獲得的ChN制備的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的乳液平均粒徑最小約10 μm，而本實(shí)驗(yàn)酸解2.5 h獲得的結(jié)晶度最高的ChN穩(wěn)定的乳液粒徑小于5 μm，粒徑減小近1/2，可能是因?yàn)楦呓Y(jié)晶度的納米晶體中無定形區(qū)域被更大地破壞，在高剪切、空穴爆炸、超聲破碎等力學(xué)作用下，形成更小更分散的納米晶體[22]，使得制備的乳液粒徑也更小。此外，30 d后的平均粒徑變化明顯，未經(jīng)酸解的幾丁質(zhì)穩(wěn)定的乳液粒徑顯著減小，僅納米級(jí)，從圖8g可以看出，原始幾丁質(zhì)形成的乳液中間部分已經(jīng)呈透明狀，下層出現(xiàn)絮狀沉淀，這已經(jīng)不再是常規(guī)意義上的乳液，因此導(dǎo)致測定的粒徑變化極大；而ChN穩(wěn)定的皮克林乳液經(jīng)過30 d的常溫儲(chǔ)藏，僅上層不同程度地出現(xiàn)分層，下層并未發(fā)生絮凝，但是平均粒徑也有增加，說明乳液的穩(wěn)定性隨時(shí)間的延長會(huì)發(fā)生改變。由圖7可以看到，結(jié)晶度最高的ChN制備的乳液0 d和30 d的平均粒徑最小，且分層最不明顯，說明隨時(shí)間的增加，結(jié)晶度越高的幾丁質(zhì)納米晶體穩(wěn)定的皮克林乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性越好。最重要的是，所有ChN穩(wěn)定的乳液在經(jīng)過30 d的常溫儲(chǔ)藏后均未出現(xiàn)透明部分，且沒有絮狀沉淀，這在常規(guī)表面活性劑穩(wěn)定的乳液中是不常見的[29]，可能是吸附在油-水界面的顆粒可以在空間上阻礙液滴的緊密接近，從而減小聚結(jié)程度[27]。由此可得，酸解之后的幾丁質(zhì)極大地提高了乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

圖8 皮克林乳液儲(chǔ)藏圖像

3 結(jié)束語

酸解時(shí)間會(huì)影響ChN的結(jié)晶度，在2.5 h內(nèi)ChN的結(jié)晶度隨時(shí)間的延長而增加，過度酸解會(huì)破壞結(jié)晶區(qū)，導(dǎo)致結(jié)晶度下降；高結(jié)晶度的ChN顆粒小、親水性好，能更充分地包裹于乳液表面，使乳液抗應(yīng)力熱穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、乳析穩(wěn)定性提高；常溫儲(chǔ)藏30 d后，ChN穩(wěn)定的乳液不會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，且分層不明顯，具有良好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。由此可得，酸解改性后結(jié)晶度越高的幾丁質(zhì)納米晶體制備的皮克林乳液越穩(wěn)定。